2016年08月31日

そろそろ秋祭り

昨日はびしょ濡れになったが、本日は日差しが厳しい。
今週、町内の秋祭りだ。すでにのぼりや場所によっては提灯も張られている。
この夏は、昨年のような猛暑ではなく、母も普通に毎日暮らすことができた。

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ただし9月4日はパット・メセニー@ブルーノート東京である。そっちはそっちで祭りだ、わっしょい。
posted by Kose at 10:21| 日記

【和モガ】「STAP細胞事件」-調査委員会の解析を妨害した方法(1)[紹介]

期待の論考。第1回である。

同じタイプのマウスのトークンがESでもSTAPでも構わないというのは揺るがない。STAPとESは関係なくてもあってもどちらでもいいのだという結論しかそれからは出ない。「わからない」という選択肢なのだ。文系の楽観的な僕が納得する分にはそれでいいのだが、科学者は「わからない」ではSTAP細胞を潰すことはできないと考えたのだろう。これはストリーに沿った調査なのでそれだけでも疑わしいが、科学者は科学者の言うことしか聞かないと言い放つのである。

和モガ氏らが検討しているのは、トークンの繁殖回数で近縁率に違いが生じ、それを踏まえると、調査委員会の分析が勘違いどころか、意図的な妨害があったとする説である。
よく読まないと容易には分からない。それは単にマウスのアルファベット記号の所為でしかない。だいぶやさしく書いていただいていることはひしひしとわかる。努力しよう。
興味を引きそうでわかりやすい部分のみチラ見せ抜粋させていただく。これれなら和モガ氏ブログで読みたくなるであろう。

「STAP細胞事件」-調査委員会の解析を妨害した方法(1)
和モガ(ブログ) 2016.08.31
http://wamoga.blog.fc2.com/blog-entry-124.html
調査委員会がFES1の混入であるとしたSTAP幹細胞FLS3について、犯人の偽装工作がどのようなものだったのか、公開された保全リストを絡めながら、あらためて書いてみたい。
ES細胞の混入ルートはFES1→129/GFP ES→FLS3だが、それぞれの細胞株について分かっていることは次の通りである。

調査結果

ここで、FES1と129/GFP ESの細胞株は1種類だが、FLS3には@FLS-3 P2(保全リスト試料No.5)とAP40 FLS-3 (No.99)とBFLS1〜8,13(No.123)の3種類ある。
・・・・・
調査委員会が調べたFLS3は当然、Bのオリジナルだと思われる。

偽装工作について書く前に、まず、調査委員会が作成した「近縁率表」から「ES細胞の混入」という結論の矛盾点を指摘しておく。

「近縁率表」とは以下のもので、近縁率が高いほど、2つの細胞はより近い関係にある。
・・・
ここで、混入に関係する3つの細胞株のそれぞれの近縁率は、「FLS3はFES1の混入によって作られた」では説明が付かないのである。

混入矛盾

(矛盾1)
FES1は2005年に凍結保存されている。作った後は研究に使わなかったとあるので、作成後そのまま凍結されたことになる。そして小保方研の冷凍庫で見つかった129/GFP ESはそのFES1を解凍・培養して作っただけの細胞株のはずである。培養すると細胞分裂を起こすので培養変異が起きSNPsも変化するが、別の129/GFP ESからFLS3になったときの変異は近縁率で99.95%である。これに比べ、FES1と129/GFP ESの近縁率が99.28%というのはあまりにも低く、その説明が付かないのである。

(矛盾2)
FES1と129/GFP ESの近縁率は99.28%でFES1とFLS3の近縁率は99.33%である。このため、混入した129/GFP ESより、それを培養して作ったFLS3の方が近縁率が高いというのは明らかに矛盾する。

では、実際にはどうなっていたかというと、下図のように、129/GFP ESとFES1はFLS3から逆に作られているはずである。これが、偽装工作である。

業務妨害1

・・・

実はこのFES1がFLS3にすり替えられたという仮説を裏付ける状況証拠がある。次回はそれについて書くことにする。


和モガで続きを読む・・・
posted by Kose at 09:31| STAP

韓国新特許要約の英文日本語訳「DEVICE AND METHOD FOR INDUCING PLURIPOTENT CELLS USING ENERGY」@SUMO Brain

特許文書だと日付関係が特有の書式のため、断定できず月名を表示したこちらの要約を掲載し、翻訳を試みた。

素人による検討
Filing Date: December 04, 2015  
Publication Date: June 09, 2016
より、ほぼ日本のSTAP関連調査等の完全終了後、出願された模様である。発行はワシントン大論文公開日と同時期である。検証が必要である。
検証(追加)
 2015/11/02 - 早稲田大は2日、2011年に授与した小保方晴子・理化学研究所元研究員の博士号の取り消しが確定したと発表した。(朝日新聞)
 ワシントン大論文 Published online:15 June 2016

基本的には、既知の幹細胞関連研究を踏まえた幹細胞化への「レーザー、超音波、熱処理の応用を装置化した発明であると思われる。
特許的には、STAP特許が実効性をもてばその引用特許の位置づけになるのではないか?
研究としては明示的なSTAP細胞への言及は今のところ認められないが、韓国の活発な幹細胞研究やSTAPを引用し、故笹井氏にあ等の意を述べたハイデルベルク大論文筆頭著者が韓国人留学生であることなどを踏まえると、異論もあると思うが、STAP概念を当然とした、その新技術(方法・装置)の発明としたと考えることができる。
 曖昧さは残るが、確信的にパクったと言って過言でない。しかし日本側(理研等)に反論材料がない。STAP特許側だけが反論可能である。
 特許はそれ自体形式的に難しく、当たり前だが秘密の部分も多いので、全く文面以上のことはあまり解釈しにくいと留保する。成立してみなければ弁理士でもわからないことはわからないだろう。係争になればさらにわからない。係争になるかどうかもわからない。

 追加:この特許の状態が申請中にすぎないのか、特許取得済みなのか、お問い合わせがあったが、弁理士の知識がないので「わからない」とお答えした。みなさんでお考えてください。

DEVICE AND METHOD FOR INDUCING PLURIPOTENT CELLS USING ENERGY
http://www.sumobrain.com/patents/wipo/Device-method-inducing-pluripotent-cells/WO2016089178A1.html

Title: DEVICE AND METHOD FOR INDUCING PLURIPOTENT CELLS USING ENERGY
Document Type and Number: WIPO Patent Application WO/2016/089178 Kind Code: A1
Abstract: The present invention relates to a device and a method for inducing pluripotent cells using energy and, more specifically, has an effect of inducing new type pluripotent cells having pluripotent characteristics by applying energy such as ultrasonic waves, lasers or heat treatment to differentiated cells.
Inventors: KIM, Soon Hag (214-1201, 54 Junganggongwon-ro, Bundang-gu,,Seongnam-si, Gyeonggi-do, 13589, KR)
Application Number: KR2015/013269
Publication Date: June 09, 2016
Filing Date: December 04, 2015
Export Citation: Click for automatic bibliography generation
BigTex

@{patent:WO/2016/089178,
title = "DEVICE AND METHOD FOR INDUCING PLURIPOTENT CELLS USING ENERGY",
number = "WO/2016/089178",
author = "KIM, Soon Hag (214-1201, 54 Junganggongwon-ro, Bundang-gu,,Seongnam-si, Gyeonggi-do, 13589, KR)",
year = "2016",
month = "June",
url = "http://www.sumobrain.com/patents/WO2016089178A1.html",
abstract = "The present invention relates to a device and a method for inducing pluripotent cells using energy and, more specifically, has an effect of inducing new type pluripotent cells having pluripotent characteristics by applying energy such as ultrasonic waves, lasers or heat treatment to differentiated cells."
}

EndNote
Patent
Author Year Title Country Assignee Number URL Abstract
KIM, Soon Hag (214-1201, 54 Junganggongwon-ro, Bundang-gu,,Seongnam-si, Gyeonggi-do, 13589, KR) 2016 DEVICE AND METHOD FOR INDUCING PLURIPOTENT CELLS USING ENERGY CATHOLIC KWANDONG UNIVERSITY INDUSTRY FOUNDATION (Kwandong Univ, 24 Beomil-ro 579beon-gil,,Gangneung-si, Gangwon-do, 25601, KR) WO/2016/089178 http://www.sumobrain.com/patents/WO2016089178A1.html The present invention relates to a device and a method for inducing pluripotent cells using energy and, more specifically, has an effect of inducing new type pluripotent cells having pluripotent characteristics by applying energy such as ultrasonic waves, lasers or heat treatment to differentiated cells.

Assignee: CATHOLIC KWANDONG UNIVERSITY INDUSTRY FOUNDATION (Kwandong Univ, 24 Beomil-ro 579beon-gil,,Gangneung-si, Gangwon-do, 25601, KR)
International Classes:C12N5/071; C12M1/42; C12M3/00; C12N5/07; C12N13/00; H01S3/00 Domestic Patent References:
2013-10-31
Foreign References:
US7052720B1 2006-05-30
Other References: CHRISTAKOU, A. E. ET AL.: "Solid Tumor Spheroid Formation by Temperature-Con- trolled High Voltage Ultrasound in a Multi-Well Microdevice''.", 18TH INTERNATIONAL CONFERENCE ON MINIATURIZED SYSTEMS FOR CHEMISTRY AND LIFE SCIENCES, 26 October 2014 (2014-10-26), San Antonio, Texas, USA, pages 573 - 575
LIU, JIAN ET AL.: "Functional Three-Dimensional HepG2 Aggregate Cultures Generated From an Ultrasound Trap: Comparison With HepG2 Spheroids", JOURNAL OF CELLULAR BIOCHEMISTRY, vol. 102, no. 5, 2007, pages 1180 - 1189
LV , YONGGANG ET AL.: "Effects of Low-Intensity pulsed Ultrasound on Cell Via-Bility, Proliferation and Neural Differentiation of induced Pluripotent Stem Cells-derived Neural Crest Stem Cells", BIOTECHNOLOGY LETTERS, vol. 35, no. 12, 28 September 2013 (2013-09-28), pages 2201 - 2212
ABRAHAMSE, HEIDE ET AL.: "The Use of Laser Irradiation to Stimulate Adipose derived Stem Cell Proliferation and Differentiation for Use in Autologous Grafts", THE 7TH INTERNATIONAL CONFERENCE ON LASER APPLICATIONS., vol. 1172, 2009, pages 95 - 100
Attorney, Agent or Firm: DANA PATENT LAW FIRM (5th Floor, New Wing Gwangsung Bldg.,,11, Yeoksam-ro 3-gil,,Gangnam-gu, Seoul, 06242, KR)
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自動翻訳に手を加えた日本語訳(人名、地名、雑誌・会議名を除く) *素人につき語彙は責任もてません

タイトル:エネルギーを利用した多能性細胞を誘導するための装置および方法
ドキュメント・タイプと番号:WIPO特許出願WO / 2016/089178種別コードA1
アブストラクト:本発明は、装置やエネルギーを使用して多能性細胞を誘導する方法に関し、より具体的には、分化した細胞に、このような超音波、レーザーまたは熱処理等のエネルギーを印加することによって、多能性特性を有する新しいタイプの多能性細胞を誘導する効果をもつ。
発明者:KIM、Soon Hag(214-1201, 54 Junganggongwon-ro, Bundang-gu,,Seongnam-si, Gyeonggi-do, 13589, KR)
出願番号:KR2015 / 013269
発行日:2016年6月9日
出願日:2015年12月4日
エクスポート引用:自動書誌生成のためにクリック
 BigTex

@ {特許:WO / 2016/089178、
 タイトル= "装置およびエネルギーを利用した多能性細胞を誘導するための方法」、
 番号= "/ 089178 WO / 2016」、
 著者= "KIM, Soon Hag(214-1201, 54 Junganggongwon-ro, Bundang-gu,,Seongnam-si, Gyeonggi-do, 13589, KR)」、 年= "2016"、 月= "6月"、
 URL = "http://www.sumobrain.com/patents/WO2016089178A1.html」、
アブストラクト= "本発明は、エネルギーを使用して多能性細胞を誘導するための装置および方法に関し、より具体的には、分化した細胞に超音波、レーザーまたは熱処理等のエネルギーを印加することによって、多能性特性を有する新しいタイプの多能性細胞を誘導する効果をもつ "
}
 EndNote
特許
著者年タイトル国譲受人数URL抽象
KIM, Soon Hag(214-1201、54 Junganggongwon-ro、盆唐区,,城南京畿道、13589、KR)
2016
エネルギーを利用した多能性細胞を誘導するための装置および方法
カトリック関東大学インダストリー・ファウンデーション
  (Kwandong Univ, 24 Beomil-ro 579beon-gil,,Gangneung-si, Gangwon-do, 25601, KR)
WO / 2016/089178
http://www.sumobrain.com/patents/WO2016089178A1.html

本発明は、装置やエネルギーを使用して多能性細胞を誘導する方法に関し、より具体的には、分化した細胞に、このような超音波、レーザーまたは熱処理などのエネルギーを印加することによって、多能性特性を有する新しいタイプの多能性細胞を誘導する効果を有します。

譲受人:カトリック関東大学インダストリー・ファウンデーション
(Kwandong Univ, 24 Beomil-ro 579beon-gil,,Gangneung-si, Gangwon-do, 25601, KR)
国際クラス:C12N5 / 071; C12M1 / 42; C12M3 / 00; C12N5 / 07; C12N13 / 00; H01S3 / 00
国内特許参照:2013年10月31日
外国参考文献:
US7052720B1 2006-05-30
その他の参考資料:
CHRISTAKOU、A. E.等:「マルチウェルマイクロデバイスにおける温度制御の高電圧超音波による固形腫瘍スフェロイド形成」、18TH INTERNATIONAL CONFERENCE ON MINIATURIZED SYSTEMS FOR CHEMISTRY AND LIFE SCIENCES, 26 October 2014 (2014-10-26), San Antonio, Texas, USA, pages 573 - 575
LIU、JIAN等:「超音波トラップから生成機能の三次元のHepG2集計文化:HepG2細胞スフェロイドとの比較」、JOURNAL OF CELLULAR BIOCHEMISTRY, vol. 102, no. 5, 2007, pages 1180 - 1189
LV、YONGGANG等:「細胞の生存率、増殖能および多能性幹細胞由来の神経堤幹細胞を誘導されるの神経分化における低強度の超音波の効果」、
BIOTECHNOLOGY LETTERS, vol. 35, no. 12, 28 September 2013 (2013-09-28), pages 2201 - 2212
ABRAHAMSE, HEIDE等:「自家移植片における使用のための脂肪由来幹細胞の増殖と分化を刺激するためのレーザー照射の使用」、THE 7TH INTERNATIONAL CONFERENCE ON LASER APPLICATIONS., vol. 1172, 2009, pages 95 - 100
弁護士、エージェントまたは事務所:
DANA PATENT LAW FIRM
(5th Floor, New Wing Gwangsung Bldg.,,11, Yeoksam-ro 3-gil,,Gangnam-gu, Seoul, 06242, KR)
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posted by Kose at 07:08| STAP

2016年08月30日

【韓国特許文書】​多能性細胞のエネルギーを用いた誘導装置及び方法(自動翻訳版)

自動翻訳版「​多能性細胞のエネルギーを用いて誘導装置及び方法」 WO/2016/089178
韓国の新幹細胞(physics細胞)特許文書のテキスト自動翻訳版のコピー
*これもまた「有志の会」ちゃんと読んでねさんのご指導によるものである。

かなりの分量がある。
​(Ko) ​技術分野本発明は、多能性細胞のエネルギーを利用する装置および方法に関する前記誘導より詳細に分化した細胞を超音波レーザ処理または熱処理に対してエネルギーを印加する例えば、多能性の新しいタイプにさせる効果があり、この多能性細胞である

自動翻訳なので若干わかりにくいが超音波、レーザー、熱処理などのエネルギー処理で多能性細胞を作る装置と方法だそうである。
超音波、レーザー、熱処理ともにオリジナルのSTAP特許の請求事項13に列挙されている。
このような幹細胞化を物理的手段で引き起こすことをもって故笹井芳樹博士がSTAP(刺激惹起性多能性獲得細胞:Stimulus-Triggered Acquisition of Pluripotency cells)と名付けた。
間違いなく、「刺激惹起性多能性獲得細胞」にほかならず、STAP特許によって牽制されるであろう。

参考 STAP特許 英語
https://patentscope2.wipo.int/search/en/detail.jsf?docId=WO2013163296&recNum=1&maxRec=&office=&prevFilter=&sortOption=&queryString=&tab=PCT+Biblio

なお図は2つを除き省略したが、「図」のページの図はキャプチャーした。

取りあえず掲載するが、あとでまた検討できたら検討する。

https://patentscope2.wipo.int/search/en/detail.jsf?docId=WO2016089178&recNum=1&maxRec=&office=&prevFilter=&sortOption=&queryString=&tab=PCT+Biblio
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ブックマーク
国際公開番号: WO/2016/089178 国際出願番号: PCT/KR2015/013269
国際公開日: 09.06.2016 国際出願日: 04.12.2015
IPC:
C12M 1/42 (2006.01), C12M 3/00 (2006.01), C12N 13/00 (2006.01), C12N 5/07 (2010.01), C12N 5/071 (2010.01), H01S 3/00 (2006.01)

出願人: CATHOLIC KWANDONG UNIVERSITY INDUSTRY FOUNDATION [KR/KR]; (Naegok-dong) Kwandong Univ., 24, Beomil-ro 579beon-gil, Gangneung-si, Gangwon-do 25601 (KR)
発明者: KIM, Soon Hag; (KR)
代理人: DANA PATENT LAW FIRM; 5th Floor, New Wing, Gwangsung Bldg., 11, Yeoksam-ro 3-gil, Gangnam-gu, Seoul 06242 (KR)
優先権情報:
10-2014-0173007 04.12.2014 KR
10-2015-0172501 04.12.2015 KR
発明の名称: ​(EN) ​装置及び誘導方法は、多能性細胞を用いてエネルギー
​(FR) ​装置および方法は誘導多能性細胞のエネルギーを使用する
​(Ko) ​多能性細胞のエネルギーを用いて誘導装置及び方法
要約: front page image
​(En) ​本発明の装置および方法に関するものを誘導するための多能性細胞のエネルギーを用いて、より詳細には、の効果を誘導する新しいタイプの多能性細胞を多能性特性などのエネルギーを加えて超音波、レーザまたは熱処理する分化細胞である
​(FR) ​技術分野本発明は、装置および誘導方法多能性細胞が電力を使用して、より詳細には、効果を有する誘導多能性細胞の新しいタイプを有する多能性特性などのエネルギーを加えて超音波レーザで熱処理された分化した細胞である
​(Ko) ​技術分野本発明は、多能性細胞のエネルギーを利用する装置および方法に関する前記誘導より詳細に分化した細胞を超音波レーザ処理または熱処理に対してエネルギーを印加する例えば、多能性の新しいタイプにさせる効果があり、この多能性細胞である
指定国: AE, AG, AL, AM, AO, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BH, BN, BR, BW, BY, BZ, CA, CH, CL, CN, CO, CR, CU, CZ, DE, DK, DM, DO, DZ, EC, EE, EG, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, GT, HN, HR, HU, ID, IL, IN, IR, IS, JP, KE, KG, KN, KP, KZ, LA, LC, LK, LR, LS, LU, LY, MA, MD, ME, MG, MK, MN, MW, MX, MY, MZ, NA, NG, NI, NO, NZ, OM, PA, PE, PG, PH, PL, PT, QA, RO, RS, RU, RW, SA, SC, SD, SE, SG, SK, SL, SM, ST, SV, SY, TH, TJ, TM, TN, TR, TT, TZ, UA, UG, US, UZ, VC, VN, ZA, ZM, ZW.
African Regional Intellectual Property Organization (BW, GH, GM, KE, LR, LS, MW, MZ, NA, RW, SD, SL, ST, SZ, TZ, UG, ZM, ZW)
Eurasian Patent Organization (AM, AZ, BY, KG, KZ, RU, TJ, TM)
European Patent Office (AL, AT, BE, BG, CH, CY, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, FR, GB, GR, HR, HU, IE, IS, IT, LT, LU, LV, MC, MK, MT, NL, NO, PL, PT, RO, RS, SE, SI, SK, SM, TR)
African Intellectual Property Organization (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GQ, GW, KM, ML, MR, NE, SN, TD, TG).
国際公開言語: Korean (KO)
国際出願言語: Korean (KO)


明細書

発明の名称
技術分野

1
背景技術

2 3
発明の詳細な説明

技術的な課題

4
課題を解決する手段

5 6 7 8 9
発明の効果

10
図面の簡単な説明

11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76
発明を実施するための最良の形態

77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121
発明を実施するための形態

122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244
産業上の利用可能性

245
請求の範囲

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
図面

1 図2a 図2bの 第3a 図3b 4 5 6 図7aの 7bは 図8Aの 8B 9Aの 9Bの 10Aの 10B 11 12 13 14 15 16aは 16bとの 16C 17 18 19 20 21aと 21bの 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44aは 44bとの 44C 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57


Full Text
明細書

発明の名称:エネルギーを利用した多能性細胞の誘導装置及び方法
技術分野

[1]
本発明は、超音波、レーザーまたは熱処理などのエネルギーの提供を通じて、多​​能性の特性を持つ多能性細胞を誘導することができるエネルギーを利用した多能性細胞の誘導装置及び方法に関するものである。

背景技術

[2]
多能性(pluripotency)は、三種類の胚葉系統、すなわち外胚葉、中胚葉、および内胚葉に分化する能力である。多能性幹細胞は、それらが体内で任意の細胞または組織タイプを発生させるため、疾患モデルと移植で臨床的に重要である。したがって、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞(induced pluripotent stem cell、iPSC)、体細胞と患者 - 由来の細胞のリプロ​​グラミングまたは分化の現在の主な要件は、臨床適用のために外来遺伝物質または化学物質または小分子の導入なし簡単で、高速、効果的かつ安全でなければならないというものである。最近の研究では、環境と遺伝子型との間の相互作用は、生きている有機体の遺伝子発現と表現型の変化と密接に関連していることが証明された。構造、機械、磁気、超音波信号のような環境刺激を調節することにより、細胞の運命、増殖および細胞の吸収効率を調節することができる。これらのアプローチの正確な分子メカニズムはまだ不明か、これらの方法は、遺伝物質、化学物質、および小分子の導入なしに安全性を実装することができる代わりに、受け入れられるに値する。
[3]
この点で、本発明者らは、遺伝子や化学物質が存在しない条件で細胞環境の信号を利用したエネルギーの提供を通じて、未分化マーカーと外胚葉、中胚葉、および内胚葉からなる3胚葉のマーカー遺伝子を発現し、3胚葉に分化する多能性特性を持つ新しい多能性細胞、いわゆるphysics細胞(p luripotent sp h ere y ielded by ultra s細胞 on ic s timulus)を誘導するための新しい方法を開発することにより、本発明を完成した。

発明の詳細な説明

技術的な課題

[4]
本発明の目的は、分化した細胞での逆分化誘導因子と化学物質の導入なしにエネルギーの提供を通じて、分化した細胞から多能性特性を有する新しいタイプの多能性細胞を誘導する方法及びその誘導装置を提供するある。
課題を解決する手段

[5]
上記目的を達成するために、本発明は、培養培地と分化された細胞を混合し、上記の混合物にエネルギーを提供して、一定時間培養を介してスペインロイド(spheroid)を形成することを含み、
[6]
上記スペロイドは多能性(pluripotency)特性を持つものである、分化した細胞で多能性細胞への逆分化方法を提供する。
[7]
本発明は、また、細胞および培養培地を収容することができる培養チャンバー; 前記培養室の一側に配置され、上記細胞および培養培地にエネルギーを提供することができる装置を含み、分化された細胞と培養培地を混合して、
[8]
上記の混合物にエネルギーを提供して、一定時間培養を介してスペインロイド(spheroid)を形成し、
[9]
上記スペロイドは多能性(pluripotency)特性を持つものである、多能性細胞の誘導装置を提供する。
発明の効果

[10]
本発明は、分化した細胞での逆分化誘導因子と化学物質の導入なしに、適切な超音波、レーザーまたは熱処理等によるエネルギーの提供を通じて、分化した細胞で多能性の特性を持ちながら、公知の誘導多能性幹細胞に比べて分化属性が強い新しいタイプの多能性細胞を誘導する効果がある。
図面の簡単な説明

[11]
図1は、本発明による多能性の特性を有する人Physics細胞の模式図である。
[12]
図2aは、人の皮膚繊維芽細胞の超音波強度の効果を示したもので、a)は、超音波の強度星HDFの形態変化の比較、b)は、超音波の強度別に生成された多細胞スペロイドの数である。
[13]
図2bは、人の皮膚繊維芽細胞の超音波強度の効果を示したもので、c)は、超音波処理されたHDFの生きている/死んだ細胞の分析の結果、d)は、上記c)で生きていると損傷した細胞の割合である。
[14]
図3aは、1 W / cm 2の固定された強度の下で超音波露光時間の効果を示したもので、a)は、超音波露出時間別HDFの形態変化の比較、b)は、超音波露出時間ごとに生成された多細胞スペロイドのことである。
[15]
図3bは、1 W / cm 2の固定された強度の下で超音波露光時間の効果を示したもので、c)は、超音波処理されたHDFの生きている/死んだ細胞の分析の結果、d)は、上記c)で生きていると損傷した細胞の割合ある。
[16]
図4は、人ESC培養培地の超音波強度の効果を示したもので、上部には、超音波処理された培地で育った超音波 - 処理されたHDFの形態変化の比較、下段は上記で生成された多細胞スペロイドの数である。
[17]
図5は、5 W / cm 2の固定されたガンドハで人ESC培養培地の超音波露光時間の効果を示したもので、a)は、超音波処理された培地で育った超音波-処理されたHDFの形態変化の比較、b)は、上記a)で生成された多細胞スペロイドの数である。
[18]
図6は、多細胞スペロイドを生成するための超音波処理条件及び培養条件の効果を示したもので、a)は、浮遊培養、b)は、断層培養である。
[19]
図7aは、浮遊培養条件下で超音波刺激の星(UC、UM、UCUM)で生成された多細胞スペロイドのサイズ分布を示したもので、a)は、合計サイズ、b)は、50-100㎛サイズのスペースロイドの分布である。
[20]
も7bは、浮遊培養条件下で超音波刺激の星(UC、UM、UCUM)で生成された多細胞スペロイドのサイズ分布を示したもので、c)は100-200㎛、d)は、>200㎛サイズのスペースロイドの分布ある。
[21]
も8aは、単層培養条件下で超音波刺激の星(UC、UM、UCUM)で生成された多細胞スペロイドのサイズ分布を示したもので、a)は、合計サイズ、b)は、50-100㎛サイズのスペースロイドの分布である。
[22]
も8bは、単層培養条件下で超音波刺激の星(UC、UM、UCUM)で生成された多細胞スペロイドのサイズ分布を示したもので、c)は100-200㎛、d)は、>200㎛サイズのスペースロイドの分布ある。
[23]
図9aは、浮遊培養と断層培養条件との間の人Physics細胞の多能性マーカー遺伝子、OCT3 / 4(a)及びSOX2(b)の発現レベルを比較したRT-PCR解析の結果である。
[24]
も9bは、浮遊培養と断層培養条件との間の人Physics細胞の多能性マーカー遺伝子、NANOG(c)およびTDGF1(d)の発現レベルを比較したRT-PCR解析の結果である。
[25]
も10aは、浮遊培養時にOCT3 / 4の発現レベルを分析した共焦点レーザー顕微鏡画像である。
[26]
も10bは、単層培養時にOCT3 / 4の発現レベルを分析した共焦点レーザー顕微鏡画像である。
[27]
図11は、培養6日間多能性マーカー遺伝子発現のRT-PCR解析の結果である。
[28]
図12は、超音波処理されたHDFスペインロイドでOCT3 / 4の発現時期を培養時間ごとに確認しRT-PCR解析の結果である。
[29]
図13は、代表未分化マーカーの発現を、ES細胞、HDFと人Physics細胞で確認した結果である。
[30]
図14は、多細胞スペインロイドの多能性状態を特性評価するためのアルカリホスファターゼ染色結果である。
[31]
図15は、多能性マーカーの発現の免疫細胞化学の結果である。
[32]
も16aは、人ES(H9)細胞表面マーカーのFACS分析の結果である。
[33]
も16bは、人HDF細胞表面マーカーのFACS分析の結果である。
[34]
も16cは、人Physics細胞表面マーカーのFACS分析の結果である。
[35]
図17は、Feeder細胞とphysics細胞の共同培養時多能性マーカーの遺伝子発現RT-PCR(a)に、タンパク質発現を免疫細胞化学法(b)で分析した結果である。
[36]
図18は、COT3 / 4とNANOGプロモーターのメチル化状態を示すバイサルファイトゲノムシーケンシングの結果である。
[37]
図19は、人Physics細胞の増殖能検証実験の結果として、a)は、増殖マーカーであるKi67の発現を示した結果、b)は、H33342とPIを利用して、増加した細胞を染色した結果、c)は、培養時間によるスペインロイドのサイズを示す。
[38]
図20は、人Physics細胞の自己 - 再生機能検証実験の結果である。
[39]
も21aは、人ES(H9)細胞から3胚葉のマーカーの発現のための免疫細胞化学分析の結果である。
[40]
も21bは、人Physics細胞から3胚葉のマーカーの発現のための免疫細胞化学分析の結果である。
[41]
図22は、人Physics細胞の培養15日間のOCT3 / 4、および3胚葉マーカーの発現パターンの免疫細胞化学分析の結果である。
[42]
図23は、超音波刺激条件別の人Physics細胞のSEM画像を示したものである。
[43]
図24は、超音波刺激条件ごとに超音波処理した後と2時間培養後、蛍光画像で見た人Physics細胞の生きている/死滅細胞の分析結果である。
[44]
図25は多細胞スペインロイドの形成後の人Physics細胞の生きている/死滅細胞の分析結果である。
[45]
図26は、超音波刺激による細胞内Ca 2 +濃度の変化である。
[46]
図27は、超音波刺激によるH 2 O 2の発生を分析した結果である。
[47]
図28は、図27の超音波処理による細胞内H 2 O 2の発生を分析するために、CM-H2DCFDAで染色された人Physics細胞の蛍光画像である。
[48]
図29は、超音波刺激による細胞内ATPの放出分析結果である。
[49]
図30は人Physics細胞でP2XとP2Y受容体の発現パターンを示したものである。
[50]
図31は、人Physics細胞のより高い浸透力をQuantum dot 705を利用して証明する共焦点顕微鏡画像である。
[51]
図32は、人Physics細胞培養培地でエキソちょっとから多能性マーカー遺伝子発現のRT-PCR解析の結果である。
[52]
図33は、人Physics細胞から放出されたエキソいくつかのOCT4によるHDFへの伝達過程を示す免疫細胞化学の結果として、黄色の矢印は、周辺HDFでOCT3 / 4の発現を示したものである。
[53]
図34は、あるビット分化誘導された人Physics細胞の3胚葉マーカーの発現の免疫細胞化学の結果である。
[54]
図35は、人Physics細胞のあるビット分化を確認するための神経系の遺伝子発現のRT-PCR解析の結果である。
[55]
図36は、人Physics細胞のあるビット分化を確認するための心臓系の遺伝子発現のRT-PCR解析の結果である。
[56]
図37は、人Physics細胞のあるビット分化を確認するための神経系のマーカー発現の免疫細胞化学の結果である。
[57]
図38は人Physics細胞のあるビット分化を確認するための心臓系統マーカー発現の免疫細胞化学の結果である。
[58]
図39は、液チニンの免疫細胞化学画像​​である。
[59]
図40は、本発明の人Physics細胞の核型分析の結果である。
[60]
図41は、人Physics細胞のマウス精巣内である秘宝分化を確認するための組織の免疫蛍光染色の結果である。
[61]
図42は、人Physics細胞のマウス太もも内である秘宝の筋肉分化を確認するための組織の免疫蛍光染色の結果である。
[62]
図43は、細胞培養培地の効果を示したもので、a)は、ES培地とHDF培養培地を用いた結果、b)は、ES培地とHDF培養培地で人Physics細胞を誘導してESマーカーを確認した結果である。
[63]
図44は、他の細胞株での人Physics細胞を誘導した結果を図示したものである。a)は、細胞の形態の変化を示した結果であり、それぞれbおよびcは、他の細胞株での人Physics細胞を誘導してb)ESマーカーとc)の3胚葉のマーカーを確認した結果である。
[64]
図45は、患者の皮膚細胞から人Physics細胞を誘導した結果を図示したものである。a)は、細胞の形態の変化を示した結果であり、b)は、他の細胞株での人Physics細胞を誘導し、ESマーカーと3胚葉のマーカーを確認した結果である。
[65]
図46は、他のエネルギーを提供源として熱処理して人Physics細胞を誘導し、ESマーカーおよび3胚葉のマーカーを確認した結果である。
[66]
図47は、他のエネルギーを提供源としてレーザーを使用して人Physics細胞を誘導し、ESマーカーおよび3胚葉のマーカーを確認した結果である。
[67]
図48は、マウス胚繊維芽細胞でマウスPhysics細胞を誘導する過程を図示したものである。
[68]
図49は、形質転換されたマウス胚繊維芽細胞(OG2 MEF細胞)に超音波処理した後、培養時間に対する細胞の形態変化とOct4発現を確認した結果として、Aは、マウスPhysicsスペインロイドでGFPの発現を確認した結果であり、BはTile scan写真で広い範囲を複数の写真を撮って合わせた写真図である。
[69]
も50は、超音波で形成されたスペロイドのGFP発現率グラフとフローサイトメトリーを用いて超音波処理された全細胞の中でGFP発現率を分析した結果である。
[70]
図51は、マウスPhysics細胞での細胞表面未分化マーカー(SSEA1)の発現をフローサイトメトリーを用いて分析した結果である。
[71]
図52は、マウスPhysics細胞から多能性マーカー遺伝子のRT-PCR解析の結果を示したものである。
[72]
図53は、マウスPhysics細胞から多能性タンパク質マーカーを、免疫細胞化学法で分析した結果である。
[73]
図54は、マウスPhysics細胞の多能性状態を特性評価するためのアルカリホスファターゼ染色結果である。
[74]
も55は、マウスPhysics細胞から3胚葉のマーカーの発現のためのRT-PCR解析の結果である。
[75]
図56は、マウスPhysics細胞から3胚葉のマーカーの発現のための免疫細胞化学法で分析した結果である。
[76]
図57は、マウスPhysics細胞の核型分析の結果である。
発明を実施するための最良の形態

[77]
以下、本発明の構成を具体的に説​​明する。
[78]
本発明は、培養培地と分化された細胞を混合し、上記の混合物にエネルギーを提供して、一定時間培養を介してスペインロイド(spheroid)を形成することを含み、
[79]
上記スペロイドは多能性(pluripotency)特性を持つものである、分化した細胞で多能性細胞への逆分化方法に関するものである。
[80]
本発明は、分化した細胞での逆分化誘導因子、化学物質などの駅分化誘導物質の導入なしに、適切なエネルギーの提供を通じて、分化した細胞から多能性(pluripotency)特性を持ちながら、公知の誘導多能性幹細胞にと比較して分化属性が強い新しいタイプの多能性細胞を誘導することができることを特徴とする。
[81]
上記多能性細胞は、外部環境に応じて分化誘導がよくされ、幹細胞の属性に比べ分化属性が強い前駆細胞(progenitor cell)の属性がより強いという点で公知の誘導多能性幹細胞と差別化された特徴を有する。つまり、誘導多能性幹細胞のような胚性幹細胞を細胞治療剤として使用する場合は、ある程度分化過程を経る準備段階が必要とされており、がんに変化することができるリスクを内包して、逆分化誘導因子の導入のために、ウイルスベクトルを使用することによる安全性の問題が台頭されるが、本発明の多能性細胞は、遺伝子変異のための逆分化誘導因子や化学物質などの駅分化誘導物質を別々に導入することなく誘導されるので、他の種類の細胞と共同培養をによる培養が不要細胞の汚染(他の細胞が混合される問題)問題がなく、ある秘宝実験でがん細胞と同様のテラトーマを形成していない癌の発生の問題がなく、安全性が確保されている。つまり、本発明の多能性細胞は、誘導過程が単純で短く自家細胞を処理して、移植するまでの時間を大幅に短縮することができる利点を有する。
[82]
本発明は、特異的に、培養培地と分化した細胞の両方にエネルギーを提供することで、優れた収率でスペロイドを生成することができる。
[83]
上記エネルギーは、超音波、レーザーまたは熱処理のいずれかであることができる。
[84]
本発明の多能性細胞は、OCT3 / 4、SOX2、NANOG、c-MYC、KLF4、TDGF1、SSEA4、TRA-1-60、PAX6、Nestin、Brachyury、SMA、GATA4、またはAFPのいずれかの未分化マーカーまたは中胚葉および内胚葉からなる3胚葉のマーカー遺伝子を安定的に発現することを特徴とする。
[85]
上述したように、分化した細胞での逆分化誘導因子の導入なしに多能性細胞が形成されている点について、本発明者らはエキソいくつかのとの関連性を考慮した。つまり、超音波、レーザー、または熱処理は、エネルギーによる温度上昇、ROS(reactive oxygen species)の生成の誘導、超音波によって生成されるマイクロバブルの振動、液体の流れの生成誘導、すなわち、細胞膜に沿ってマイクロストリームの生成を誘導して、これらの効果により、細胞膜に微細な損傷を入れ、穴の作成 ​​を誘導することにより、外部の物質の吸収が増加するようにするために、これは細胞内Ca 2 +濃度の変化の分析とH 2 O 2生成するかどうかを確認することにより、証明される。つまり、細胞内Ca 2 +濃度変化の分析は、細胞膜に損傷や膜の流動性が増加した場合、瞬間的に細胞内(cytosol)Ca 2 +濃度が増加することを反映して、細胞膜の流動性の増加を確認することで、本発明の一具体例によれば、超音波処理の直後Ca 2 +濃度が急速に増加している途中、徐々に減少して超音波を処理していない対照群のレベルに減少することを介して細胞膜の損傷が誘導された後、回復さを知ることができた。また、細胞内H 2 O 2生成するかどうかを確認し、実験も同様のパターンで初期超音波処理の直後には、H 2 O 2生成量が増加している徐々に対照群のレベルに減少することを介して細胞膜の損傷が誘導された後、回復さを知ることができあった。また、ATPが、様々な細胞性ストレスへの反応信号として利用されて、超音波処理した後多能性細胞からのATP濃度を分析した結果、未処理対照群に比べて高いレベルでATPを放出した。併せて、ATP放出によるイオン指向性P2X受容体と代謝P2Y受容体の発現も多能性細胞で対照群に比べ有効になった。
[86]
一方、エキソいくつかの内部に遺伝情報物質(DNA、mRNA、microRNA、protein)を含んでいることが知られているが、細胞膜の損傷を介して細胞膜の外に出てきたエキソいくつかの周りの他の細胞に再び入るプロセスを介してエキソいくつかの内部に存在する遺伝情報物質が配信されることができる。したがって、超音波処理による刺激により、細胞内低発現されるか発現が抑制された状態に維持された未分化マーカーの発現が誘導ないし促進されると同時に、細胞膜に損傷が生ずるに応じて、上記発現が誘導ないし促進された未分化マーカーを含まれている細胞内に存在するエキソちょっとが外部に排出され、周囲の細胞に伝達されるが周辺の細胞も細胞膜が部分的に破損した状態であるため、細胞膜の流動性が増加して細胞内にエキソちょっとが入る効率が通常の状態に比べて、より高いと推定され、このようなエキソいくつかの内部に存在する前記発現誘導ないし促進された未分化関連遺伝子情報が伝達されて多能性細胞が作られると考えられた。本発明の一実施例では、多能性細胞の誘導過程の中で培養培地を回収し、培地内エキソいくつかのを抽出してエキソいくつかの内部に多能性細胞に関連する未分化​​マーカーが存在するか確認した結果、既知の未分化マーカーが高い発現レベルを見せながら確認され、本発明者らのこのような仮説を裏付けるものと考えられる。また、このような超音波、レーザー、または熱処理にも核型奇形がなく、正常なことが分かった。
[87]
これらの仮説は、細胞膜の損傷によるエキソいくつかの放出の誘導を介して多能性細胞を製造することができることを可能にする。
[88]
本明細書では、用語「多能性細胞」は、エネルギー、厳密な意味での超音波、レーザー、または熱処理後の多能性を獲得した細胞をいう。本明細書において、上記性性胚性幹細胞で発現される未分化マーカーを安定的に発現する状態を意味する。併せて、三種類の内胚葉、外胚葉および中胚葉の3胚葉マーカーを発現する状態を意味する。上記多能性細胞は、「Physics(p luripotent sp h ere y ielded by ultra s on ic s timulus)細胞」、または「Physicsスペロイド」と混用して使用することができる。本発明の分化した細胞で多能性細胞への逆分化方法を図面1を参照して、具体的に説明すると、次の通りである。
[89]
まず、細胞培養培地と分化された細胞を混合し、上記の混合物にエネルギーを提供する。
[90]
分化した細胞の混合物にエネルギーを提供する前に、細胞培養培地にエネルギーを提供して多能性細胞での逆分化効率を高めることができる。
[91]
上記エネルギーは、超音波、レーザーまたは熱処理のいずれかであることができる。
[92]
上記培養培地の超音波処理は、出力強度1W / cm 2 から20W / cm 2の超音波を1〜20分、具体的には、出力強度2W / cm 2 から10W / ​​cm 2の超音波を5〜15分、より具体的には、出力強度3W / cm 2 乃至7W / cm 2の超音波を7〜13分間の間中に実行する可能性がある。
[93]
培養培地のためのレーザー処理は、300〜900 nmの波長帯域のパルス型レーザービームを1秒〜20秒、より具体的には、上記波長帯域のパルス型レーザービームを3秒〜10秒、より具体的に、上記波長帯域のパルス型レーザービームを4秒〜6秒の間照射する可能性がある。上記波長帯域は、例えば400 nm、808 nm、880 nmの波長を使用することができる。
[94]
培養培地の熱処理は、40〜50℃の温度条件で5分〜20分の間行うことができる。
[95]
上記培養培地で、胚性幹細胞培養培地、幹細胞の分化誘導培地などを用いることができる。
[96]
上記分化した細胞で、哺乳類由来の繊維芽細胞; 子宮頸がん細胞(HeLa cell)を含む癌細胞; または肺上皮細胞(L132 cell)を含む気管内組織の細胞などを用いることができる。
[97]
分化された細胞にエネルギーを提供する場合、一定の世紀に露出させることがよく、この範囲を外れた場合、細胞生存率が減少することができる。
[98]
したがって、培養培地と分化した細胞の混合物の超音波処理は、出力強度0.5W / cm 2から3W / cm 2で1〜5秒間、より具体的には、出力強度0.7W / cm 2から2W / cm 2 1〜5秒間、より具体的には、出力強度0.8W / cm 2から1.5W / cm 2で1〜5秒間実行する可能性がある。
[99]
培養培地と分化した細胞の混合物のためのレーザー処理は、300〜900 nmの波長帯域のパルス型レーザービームを1秒〜20秒、より具体的には、上記波長帯域のパルス型レーザービームを3秒〜10秒、より具体的には、上記波長帯域のパルス型レーザービームを4秒〜6秒の間照射する可能性がある。上記波長帯域は、例えば400 nm、808 nm、880 nmの波長を使用することができる。
[100]
培養培地と分化した細胞の混合物の熱処理は、40〜50℃の温度条件で1分〜10分の間の露出した後、0℃〜4℃の温度条件で5〜10秒間露出して実行する可能性がある。
[101]
次に、エネルギーが提供された混合物を一定時間の間培養して多能性を持つスペインロイド(spheroid)を形成させる。
[102]
エネルギーが提供された混合物の培養は、浮遊培養(suspended culture)または単層培養(monolayer culture)方式を使用して未分化マーカーを安定的に発現するスペロイドが形成されている期間、つまり、3日〜10日の間実行する可能性がある。ただし、上記の培養時間は、培養方法、細胞または培養培地の種類に応じて、多能性を有するスペースロイド形成するかどうかが決まり、当業者のレベルで適切に調節することができる。
[103]
本発明の一具体例によれば、浮遊培養は、単層培養に比べて、より高いスペロイド形成効率を示す。また、浮遊培養は、単層培養に比べてスペースロイドの数と大きさがより大きく、一定の大きさの分布を示す。
[104]
本発明の一具体例によれば、超音波やレーザー処理された人の皮膚繊維芽細胞の浮遊培養時に約3日目から未分化マーカーの発現が増加したり、安定され、この時期から逆分化が開始されているものと思われる。また、熱処理された人の皮膚繊維芽細胞の浮遊培養時の約8日目から未分化マーカーの発現が増加したり、安定され、この時期から逆分化が開始されているものと思われる。
[105]
未分化マーカー、例えば、OCT3 / 4、SOX2、NANOG、c-MYC、KLF4、TDGF1、SSEA4、TRA-1-60などが発現されることを介してスペロイドが多能性を有することが確認できる。未分化マーカーの確認は、RT-PCRまたは免疫細胞化学法を使用して分析することができるが、これに特に制限されるものではない。
[106]
また、本発明の多能性細胞は、3胚葉のマーカー、すなわち、外胚葉(PAX6、Nestin)、中胚葉(Brachyury、SMA)、内胚葉(GATA4、AFP)マーカーを高いレベルで発現する特徴を示す。
[107]
また、本発明の多能性細胞は、増殖マーカータンパク質であるKi-67を発現して増殖能を持つ特徴がある。
[108]
また、上記の逆分化された多能性細胞を栄養細胞と共培養した場合多能性細胞の増殖が増加して、分化誘導培地で培養した後、外胚葉/内胚葉/中胚葉および神経細胞/心筋細胞に分化されていることを確認することができている。
[109]
[110]
本発明は、また、
[111]
細胞および培養培地を収容することができる培養チャンバー; と
[112]
上記培養チャンバーの一側に配置され、上記細胞および培養培地にエネルギーを提供することができる装置を含み、
[113]
分化された細胞と培養培地を混合して、上記の混合物にエネルギーを提供して、一定時間培養を介してスペインロイド(spheroid)を形成し、上記スペースロイドは多能性(pluripotency)特性を持つものである、多能性細胞誘導装置を提供する。
[114]
上記培養チャンバーは、通常の細胞培養に使用される培養器を意味する。例えば、培養チャンバーは、温度制御部と二酸化炭素制御部が備えられており、培養チャンバー内の細胞培養条件は、目的と細胞の種類に応じて、当業者のレベルで適切に調節することができる。
[115]
また、上記培養チャンバーは、分化した細胞で多能性細胞に逆分化させることにおいて、浮遊培養または単層培養の方法を使用することができていて、これらの培養が可能な構造になっているのがよい。例えば浮遊培養のための攪拌機を備えた培養室であることができる。
[116]
上記エネルギーを提供することができる装置は、超音波を照射することができる超音波発生装置、レーザーを照射することができるレーザー発生装置、または温度調節装置を含むことができる。
[117]
超音波発生装置は、周波数が10kHz乃至100MHzである超音波を発生する公知の超音波装置であれば制限なく使用することができる。
[118]
上記レーザー発生装置は、300〜900 nmの波長帯域のパルス型レーザービームを発生し、1〜15Wの出力で、パルス持続時間が1msから900msであり、周波数が1〜100Hzであるレーザー装置を使用することができますが、これに特に制限するものではない。
[119]
温度調節装置は、-40℃〜99.9℃の範囲の温度調節が可能な公知の温度調節装置を使用することができますが、これに特に制限されるものではない。
[120]
本発明の多能性細胞の誘導装置は、培養培地と分化した細胞の混合物に超音波発生装置、レーザー発生装置、または温度調節装置を用いて、超音波、レーザー、または熱処理して、一定時間培養を介して多能性を持つスペインロイド(spheroid)を形成することにより、分化した細胞で多能性細胞に逆分化させることができる。この時、逆分化効率を高めるために培養培地を分化された細胞と混合する前に、培養培地に超音波、レーザー、または熱処理を事前に行うことができる。
[121]
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。ただし、下記の実施例は、本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容が下記の実施例に限定されるものではない。
発明を実施するための形態

[122]
<実施例1> Physics細胞の製造
[123]
図1は、本発明のPhysics(p luripotent sp h ere y ielded by ultra s on ic s timulus)細胞の形成の模式図で、5W/cm 2の強度で10分間超音波処理したES(embryonic stem)培地に人の皮膚繊維芽細胞(HDFa、Cat。No. C-013-5C、GIBCO(Invitrogen cell culture))(1×10 6)を混合し、細胞を含む混合物に超音波を5秒間1W / cm 2の強度で処理した。生きている細胞を選別した後、35 mm細菌用ペトリ皿で2×10 5のHDFを人ES培養培地で6日間浮遊培養した。
[124]
培養1日目からスペインロイド(spheroid)が形成され、3日以降から未分化マーカーが発現される。
[125]
[126]
<実験例1>スペインロイド形成の最適条件の実験
[127]
人の皮膚繊維芽細胞は、超音波処理時スペロイドを形成するのでスペースロイド形成効率を高めるための最適条件を確立するために、超音波処理条件、細胞培養方式などを異にして実験した。
[128]
細胞培養方法は、細胞培養皿の表面がコーティングされていないプレート(細菌用ペトリ皿)で培養する浮遊培養(Suspended culture)と細胞培養皿の表面がコーティングされて、細胞が表面によくつくプレート(組織培養皿)で培養する断層培養(Monolayer culture)を使用した。
[129]
また、対照群には何の処理をしていないグループ(Null)、培地に超音波を処理したグループ(UM:Ultrasound treated Media、5W / cm 2の超音波強度で10分間処理)、細胞に超音波を処理したグループ(UC :Ultrasound treated Cell、1W / cm 2の超音波強度で5秒間処理)と細胞と培地に超音波を処理したグループ(UCUM:UM + UC)に分け、培養時間による細胞の形態の変化を観察し、スペインロイドの数を測定し、培養時間に応じたスペースロイド数とサイズの変化を分析することにより、スペースロイド形成効率を確認した。実験対象の細胞は、人の皮膚繊維芽細胞である。
[130]
まず、超音波強度の条件を確立するために、超音波強度(5秒間0、0.5、1、3、5、10 W / cm 2)でHDF(1×10 6)に直接さらさせた。生きている細胞を選別した後、35 mm細菌用ペトリ皿で2×10 5のHDFを人ES培養培地で6日間培養した。
[131]
[表1] ES培地組成
試薬名 容量 最終濃度 備考
DMEM / F-12 500ミリリットル 500ミリリットル
血清代替(ノックアウトトレードマーク(TM)血清代替) 100mLの 20%
油圧(非必須アミノ酸) 5mLの 1%
P / S(Peniciline&ストレプトマイシン) 5mLの 1%
β-メルカプトエタノール 0.9mL 0.1mMの
グルタミン(L-グルタミン、200mMの溶液) 2.5mLの 1mMの
基本的なヒト線維芽細胞増殖因子2(FGF)(組換えヒトFGF-基本) 2mgの 4ng / mLの 超音波処理した後に添加

[132]
[133]
図2aの(a)に示すように、0.5、1および3 W / cm 2の超音波強度で、超音波処理されたほとんどのHDFは自発的に凝集され、多細胞スペインロイドを形成した。対照群は、プレートの表面に付着しているが、5および10 W / cm 2 の強度の超音波処理されたHDFは、スペインロイド形成せずに細胞死が増加した。
[134]
図2aの(b)は、図2aの(a)から、超音波の強度別に生成された多細胞スペロイドのことを示したものである。
[135]
1 W / cm 2の超音波強度で生きている/死んだ細胞の分析および画像解析の結果、図2cおよび2dに示すように、25%の細胞が部分的に損傷を受け、95%以上の細胞センジョンヌンが維持された。しかし、1 W / cm 2 よりも高い超音波強度で、HDFは深刻な損傷を受けて細胞死滅に至った。
[136]
したがって、1 W / cm 2 の固定された超音波の強度条件で、露出時間(0、1、2、5、10、20、40秒)を異にして、35 mmの細菌のペトリ皿で人ES細胞培養培地で3日間培養した。
[137]
図3a及び3bの(a) - (d)に示すように、超音波に5秒間露光させた場合、生成されたスペロイドのことは、他の露光時間に比べて最も高かった。しかし、10秒以上の露出した場合、細胞死が劇的に増加したが、これは細胞膜の損傷に起因したものと見られる。
[138]
次に、ES細胞培養培地に超音波暴露強度(0、1、5、10 W / cm 2)を異にして、10分間処理した。35 mm細菌用ペトリ皿で超音波露出された2×10 5 HDF(1 W / cm 2、5秒)を、これらの培地で3日間培養した。
[139]
図4に示すように、1W / cm 2よりも5 W / cm 2 の超音波処理された培養培地で約2倍のスペースロイドが発生した。
[140]
露出時間(0、5、10、20分)の変化は、スペインロイド形成効率について有意な効果を示さなかった。一般的に、短い露光時間が一定の大きさの範囲と、より多くの数を引き起こした(図5)。
[141]
次に、培養条件を異にしたときスペクロイド形成効果を調査するために、ESC培養培地に超音波を処理して、(5 W / cm 2、10分)、HDF(1×10 6)に超音波を処理した( 1 W / cm 2、5秒)。生きているHDF(×10 5)を選別した後、細菌用ペトリ皿で浮遊培養するか、組織培養皿で単層培養を行った。
[142]
図6に示すように、浮遊培養(suspended culture)された超音波 - 処理されたHDFは、単層培養されたものと比較して、より高いスペロイド形成効率を示した。そして、超音波の刺激を細胞と培養培地の両方に刺激を与えたときより高いスペロイド形成効率を示した
[143]
浮遊培養または単層培養下で超音波刺激ごとに生成された多細胞性スペクロイドのサイズ分布を見るために、超音波処理されたHDFまたは非処理HDFを細菌用ペトリ皿または組織培養皿で超音波処理または非処理されたES培養培地で培養した。
[144]
図7及び図8に示すように、両方の培養皿で、HDFと培養培地の両方超音波処理される(UCUM)より高いスペロイド形成効率が観察された。
[145]
また、浮遊培養条件は、より高い効率を示しており、スペインロイドは数とサイズの面で大きく(200㎛以上の直径)、断層培養(monolayer culture)の条件よりも、一定の大きさの分布を示した。
[146]
非処理されたES細胞培養培地で育った超音波処理されたHDF(UC)は、スペインロイドを形成した。しかし、UCUM条件と比較して、スペインロイドの数と大きさ(200㎛まで)は、あまりにも低い。超音波処理されたES細胞培地で、通常のHDF培養(UM)の結果、サイズが小さい(100㎛以下)少量のスペロイドが形成された。組織培養皿を用いた単層培養のUCおよびUM条件はスペロイド形成効率があまりにも低かった。ほとんどのHDFはペトリ皿の表面に付着しており、スペインロイドことは、あまりにも小さかった。
[147]
そして、浮遊培養または単層培養下で超音波刺激ごとに生成された多細胞性スペクロイドの培養時間ごとの代表的な未分化遺伝子の発現を分析するために、前記実施例1の方法に基づいて、対照群と超音波処理されたグループ(Null、UM、UC、 UCUM)の細胞を培養時間(1、2、3、4、5、および6日)ごとに回収してDynabeadsレジスタードマークmRNA direct kit(ambion)を利用して、mRNAを抽出し、SuperScrip-A(invtrogen)cDNAを合成した後の表2​​に記載されたプライマーを用いてPCRで増幅し、電気泳動して分析した。
[148]
RT-PCRを使用して分析した結果、図9のHDFと培養培地の両方超音波処理される(UCUM)未分化マーカー遺伝子の発現が安定的に発現されており、特に浮遊培養した場合は、単層培養細胞に比べて、より高かった。
[149]
培養環境に応じた未分化の属性のスペースロイド形成の違いを確認したい浮遊培養または単層培養下で未分化マーカーであるOCT3 / 4の発現レベルを比較した。そのため、超音波処理した後、培養時間(0、1、2、3、4、5、および6日)の間培養された細胞を、4%パラホルムアルデヒドで30分間固定し、抗体の浸透能力を向上させるために0.1% TritonX100が添加されたPBSバッファに40分間露出させた後、非特異的なタンパク質の反応を防ぐために、5%non goat serumが添加されたPBSバッファで30分間室温でブロッキング処理を行った。以来、細胞を洗浄した後、それぞれの1次抗体(OCT4、1:200、abcam)を入れ、4℃でオーバーナイト反応させ、0.03%Triton X100が添加されたPBSバッファで3回洗浄した後、2次抗体(IgG anti-rabbit conjugate alexa 488)をD-PBSバッファでそれぞれ1:1000に希釈し、2時間室温で染色した。染色された細胞は、0.03%TritonX100が添加されたPBSバッファを使用して4回洗浄した後、スライドにDAPIが添加されたマウント溶液(mounting sol。)を分散させてカバースリップで覆い、マニキュアで角を密封した後、共焦点レーザー顕微鏡で観察した。
[150]
図10に示すように、興味深いことに、UCUM条件で超音波処理1日後にすぐにOCT3 / 4の発現が検出された。OCT3 / 4の発現は、徐々に増加して、浮遊培養条件は、単層培養条件よりも高い発現レベルを示した。
[151]
次に、浮遊培養にUCUM条件下でスペクロイド培養6日の間、6つの未分化マーカー遺伝子であるOCT3 / 4、SOX2、NANOG、TDGF1、c-MYCおよびKLF4をRT-PCRで分析した結果、図11にのように処理した後、1日にOCT3 / 4とNANOG遺伝子発現が増加しており、以降、他の遺伝子の発現も培養時間の経過とともに増加することが分かった。、すべてのマーカー遺伝子の発現が2日に観察されたが、安定し発現は、3日後に観察された。最初のOCT3 / 4の発現時点は、超音波処理、10時間後に、すぐに検出された(図12)。
[152]
Physics細胞の未分化能力を確認するために、4種のランダムに選別されたスペロイドでのRT-PCRの結果OCT3 / 4、SOX2、NANOG、REX1、TDGF1、FOXD3、FGF4、UTF1、ESG1、LIN28a、KLF4、c- MYCを含む多能性マーカー遺伝子の発現を確認し、人H9 ESCと、通常のHDFと比較した(図13)。実験は、5日培養されたphysics細胞を回収し、DynabeadsレジスタードマークmRNA direct kit(ambion)を利用して、mRNAを抽出し、SuperScrip-U(invtrogen)cDNAを合成した後、表2に記載されたプライマーを用いてPCRで増幅して電気泳動して分析した。
[153]
[表2]
遺伝子の名称 プライマー配列(5 ' - > 3')
OCT3 / 4 F GACAGGGGGAGGGGAGGAGCTAGG
R CTTCCCTCCAACCAGTTGCCCCAAAC
SOX-2 F GGGAAATGGGAGGGGTGCAAAAGAGG
R TTGCGTGAGTGTGGATGGGATTGGTG
NANOG F CAGCCCCGATTCTTCCACCAGTCCC
R CGGAAGATTCCCAGTCGGGTTCACC
c-myc F AAACACAAACTTGAACAGCTAC
R ATTTGAGGCAGTTTACATTATGG
Klf4の F CCCACATGAAGCGACTTCCC
R CAGGTCCAGGAGATCGTTGAA
UTF1 F CCGTCGCTGAACACCGCCCTGCTG
R CGCGCTGCCCAGAATGAAGCCCAC
LIN28 F AGCGCAGATCAAAAGGAGACA
R CCTCTCGAAAGTAGGTTGGCT
REX1 F CAGATCCTAAACAGCTCGCAGAAT
R GCGTACGCAAATTAAAGTCCAGA
FGF4 F CTACAACGCCTACGAGTCCTACA
R GTTGCACCAGAAAAGTCAGAGTTG
FOXD3 F AAGCTGGTCGAGCAAACTCA
R CTCCCATCCCCACGGTACTA
ESG1 F ATATCCCGCCGTGGGTGAAAGTTC
R ACTCAGCCATGGACTGGAGCATCC
TDGF1 F CTGCTGCCTGAATGGGGGAACCTGC
R GCCACGAGGTGCTCATCCATCACAAGG
B-ACTN F CATGTACGTTGCTATCCAGGC
R CTCCTTAATGTCACGCACGAT

[154]
[155]
アルカリフォスファターゼ(AP)染色結果、多細胞スペインロイドの多能性状態の特徴を示すことが確認された。浮遊培養されたスペロイドは断層培養されたスペクロイドより明確な赤い色を示した(図14)。
[156]
OCT3 / 4、SOX2、NANOG、SSEA-4、およびTRA-1-60の発現は、H9人、ES細胞と同様であった(図15)。また、多細胞スペインロイドの多能性特性は、フローサイトメトリーを使用して確認した(図16)。SSEA4とTRA-60の99.5%以上がスペインロイドで発現され、各発現レベルは、H9人、ES細胞と同様であった。
[157]
また、スペインロイドを移し、マウス胚繊維芽細胞(MEF)栄養細胞とゼラチン - コーティングされた組織培養プレートでボール培養(coculture)したとき、細胞拡散と成長が観察された。また、多能性マーカー遺伝子の発現が依然として維持された(図17)。
[158]
また、未分化マーカーの発現をさらに確認するために、DNAメチル化解析を行った。遺伝子発現が開始されるプロモーターの部分がメチル化がされると、その部分での遺伝子発現がされていないことがわかって、脱メチル化された場合、すなわち、DNAからメチル基が落ちた場合、その部分の遺伝子が発現されることを意味する。したがって、ES細胞の主要な遺伝子である未分化幹細胞の主要な遺伝子であるOCT3 / 4とNANOG遺伝子発現が起こっているか二つの遺伝子のプロモーター部分のメチル化の有無を調べた。
[159]
このため、PhysicsスペインロイドでDNAをproteinase Kとフェノールを用いて抽出した後、EZ DNAメチル化キット(Zymo Reaserch)を利用して、PhysicsスペロイドのOCT3 / 4とNANOG DNAメチル化を分析した。分析に用いたDNA増幅のためのプライマーは以下の通り。
[160]
1)人NANOG増幅用プライマー:
[161]
正方向プライマー:5'-TAGGAGTAGAGTGTAGAGGAGAATGAGTTA-3 '
[162]
逆プライマー:5'-ATCTATCCCTCCTCCCAAATAATC-3 '
[163]
増幅産物のサイズ:377 bp、Tm:55、産物でCpGs:6
[164]
2)人OCT4増幅用プライマー:
[165]
正方向プライマー:5'-TTTTTTTAAATTAGAAATTTTAATTATTTG-3 '
[166]
逆プライマー:5 / -AATTACAAAAACCATACCTACAACC-3 '
[167]
増幅産物のサイズ:417bp、Tm:55、産物でCpGs:4
[168]
バイサルファイトゲノムシーケンシングによって評価される多能性 - 特異OCT3 / 4、およびNANOG遺伝子のプロモーター領域でシトシングアニンダイヌクレオチド(CpG)のメチル化は、Physics細胞がES細胞と同様に、高度に脱メチル化されるが、オリジナルHDF細胞で、この領域のCpGダイヌクレオチドは、低脱メチル化が見られた(図18)。これらの結果は、OCT3 / 4とNANOGプロモーターは、超音波処理によって活性化されることを示唆している。
[169]
[170]
<実施例2> Physics細胞の増殖能および多分化能力
[171]
Physics細胞の増殖能は、増殖マーカータンパク質であるKi-67の免疫染色方法とpスト(Hoechst 33342)とプロピオンスタジアム子供織田グレード(PI)を用いた時間差の細胞の核染色を使用して評価した。
[172]
図19に示すように、5日目に、Physics細胞からKi-67の発現が検出された。
[173]
これより確実な証明のために、次のような方法を介して細胞増殖を確認した。浸透性が良く、生きた細胞の核に染色が可能なHoechst 33342を用いて、5日目の培養されたPhysics細胞を染色し、染色試薬を完全に除去した後、3日間培養してから、合計8日間培養されたPhysics細胞を4%paraformaldehydeで固定した後、さらにPIで細胞核を染色した。重複していない赤の信号は、5日後に、細胞分裂によって新たに形成されたPhysics細胞を意味する。また、動画を使用して、単一のスペースロイドを5日間培養してスペクロイド直径を測定した結果のサイズの増加を介してPhysics細胞の増殖能を証明する。
[174]
Physics細胞の自己 - 再生能力を評価するために、Hoechst 33342で染色されたPhysics細胞をさらに5日間培養してから、4%paraformaldehydeで固定した後、PIとOCT3 / 4に戻って染色した。PI信号は、Physics細胞内の核を意味する。Hoechst 33342とほぼ合併されたOCT3 / 4に比べて染色された核は、Hoechst 33342が5日前にPhysics細胞を染色したことを意味する。
[175]
図20に示すように、追加培養の5日の間、多能性特性(OCT3 / 4)が娘Physics細胞に伝達されなかった。これらの結果は、Physics細胞が増殖することができますが、5日後に自己 - 再生をしていないことを意味する。
[176]
そしてPhysics細胞の初期培養時間のために、各胚葉から特異マーカー遺伝子の発現を発見した。未分化されたと分化されたマーカーの両方に発現するPhysics細胞のユニークな遺伝子発現パターンは、人ESC由来のEBと比較だけした(図21)。なぜなら、その形態が非常に類似しているためである。
[177]
免疫細胞化学分析の結果、Physics細胞とEBは、内胚葉(GATA4、AFPなど)、外胚葉(PAX6とNestin)、中胚葉(BrachyuryとSMA)のマーカーを高く発現した。OCT3 / 4に加えて、PAX6の発現も、超音波処理した後、1イルチェに直接検出された。3胚葉の他の遺伝子の発現は、Physics細胞の生成後3日目に開始された。培養15日の間、3胚葉のマーカーの発現レベルは徐々に増加した。しかし、OCT3 / 4の発現は、8日後に減少した(図22)。
[178]
[179]
<実施例3>超音波刺激による細胞の変化
[180]
Physics細胞発生の間HDFでの超音波刺激の効果を評価するために、超音波の条件で比較した。超音波処理後および超音波処理されたHDFの2時間培養後、直接SEM分析を行った。
[181]
図23に示すように、いくつかの細胞膜気孔がUCとUCUM条件の両方に起こった。おそらく、HDFが超音波に直接さらされているからであると思われる。しかし、UM条件でHDFは、細胞膜を通過する任意の気孔発生を示さなかった。これは、培養培地のみ超音波を処理することは、細胞膜の損傷に十分ではないからである。特に、細胞培養の2時間後、生成された気孔は、UCとUCUM条件の両方消えた。これらの結果は、超音波刺激は、細胞死を誘導するのに十分深刻ではないが、細胞膜の一時的な透過を誘導するには十分であり、それ以降の初期細胞培養時期の間、破損した膜が回復さを示唆している。
[182]
破損している細胞膜の回復過程はまた、live / dead kitを用いて、細胞膜の損傷がないことは、(緑色蛍光)/死ぬか、細胞膜の損傷がある細胞は、(赤蛍光)分析によって証明された。HDF細胞に超音波処理直後と2時間が経過した後、蛍光試薬で染色した結果、2時間後に赤蛍光の割合が減ることから、SEM分析の結果と同様に、2時間後、超音波による細胞膜の損傷が回復されていることが分かった(図24)。
[183]
また、試薬を超音波刺激を受けた細胞とスペロイドの形成の関連性を確認するために、超音波処理されたHDFにlive / dead kitを付加して、緑/赤の二重染色されたHDFは、生きた細胞のイメージング装置を用いて、24時間中追跡した。
[184]
図25に示すように、HDFはただ緑または赤/緑の二重に染色された他のHDFと凝集して多細胞スペロイドを形成した。24時間後、ほとんどの少し破損しているHDFは安定Physics細胞を形成した。
[185]
超音波-誘導された細胞膜の損傷と、一時的な透過はまた、それぞれの蛍光色素Fluo-4色素とCM-H2DCFDAを使用して増加された細胞内Ca 2 +濃度と細胞内H 2 O 2 の生産によって特徴を示した。超音波を露出するとすぐ、Physics細胞のCa 2 +濃度が急激に増加してから、150秒に減少した(図26)。Physics細胞から細胞内H 2 O 2の濃度は、未処理対照群HDFと比較して、超音波暴露60分後、6倍高かった(図27および図28)。
[186]
さらに、ATPが、様々な細胞性ストレスへの反応からの信号に使用されるので、細胞外に放出されたATPの濃度を分析した。
[187]
図29に示すように、超音波は、未処理のHDF比Physics細胞からATPの22倍以上の放出を刺激した。
[188]
イオン指向性P2X受容体と代謝性P2Y受容体は、ATPの放出によって発現が活性化されることが知られており、これらの受容体の発現を比較した。
[189]
Physics細胞でP2X4、P2X7、P2Y1、P2Y2およびP2Y11のより高い発現が検出された(図30)。
[190]
Physics細胞の改良された細胞の吸収は、追加のAlexa-705標識された量子ドット(QD705)を利用して確認した。QD705をペトリ皿に付加し、24時間後、共焦点顕微鏡画像を得た。
[191]
スペインロイドタイプ内Physics細胞と隣接する単一Physics細胞と凝集していない単一の細胞タイプの両方、QD705を吸収した。しかし、通常のHDFはQD705を吸収しなかった(図31)。これは、外部の要素の細胞吸収が超音波刺激によって向上を実証するものである。
[192]
一方、エキソちょっとRNAはPhysics細胞培養培地から準備されており、RT-PCR解析を介してPhysics細胞の発生の間の細胞培養環境の遺伝子発現パターンを研究した。一般的に、エキソちょっとはいくつかの遺伝子要素、例えば、RNA、microRNA、DNA、タンパク質を含んでいる。また、エキソいくつかの遺伝子要素の発現プロファイルは、細胞の状態 - 依存である。
[193]
図32に示すように、多能性マーカー遺伝子の高い発現がPhysics細胞培養培地から精製されたエキソちょっとで観察された。最も顕著な遺伝子発現は、OCT3 / 4、およびNANOGであった。培養時間が進むにつれ、OCT3 / 4の発現は著しく増加した。NANOG発現は、4日後に低下した。c-MYC発現は、浮遊培養条件で一定のに対し、断層培養条件で2日後に減少した。すべての多能性マーカー遺伝子、例えば、REX1、TDGF1、FOXD3、UTF1、LIN28の発現は、たとえ彼らの発現レベルがナトギン一つ浮遊培養条件で検出された。しかし、これらの遺伝子は、単層培養条件では検出されなかった。これらの結果は、超音波処理されたHDFの遺伝子要素の伝達の可能性を示唆している。
[194]
この仮説を立証するために、超音波 - 未処理されたHDFをPhysics細胞と共培養した。イメージング分析のために、リポペックビタミンによってCy5.5赤い蛍光色素をHDFに感染させた。Physics細胞は別に生成され、2日保持した後、Physics細胞をCy5.5-感染HDFペトリ皿に付加した。ボール培養中、培養培地に超音波を処理しませんでした。これは、UM条件も多能性マーカー遺伝子の発現を誘導することができるからである。
[195]
共焦点顕微鏡画像は、Physics細胞との共培養中にCy5.5-感染したHDFからOCT3 / 4の発現が観察された。OCT3 / 4の発現は、Cy5.5-感染HDF単独培養では検出されなかった。これらの結果は、Physics、細胞の多能性特性が隣接する正常細胞に伝達され、後に正常細胞のPhysics細胞でのリプログラミングを強く証明する。一般的に、細胞の遺伝子要素配信エキソちょっとが参加する(図33)。
[196]
[197]
<実施例4> Physics細胞のあるビット分化
[198]
あるビット分化のために5日培養されたPhysics細胞をゼラチンがコーティングされた組織培養皿に移した。移した細胞は、特異分化培地を用いて、神経や心臓系統への分化を誘導した。上記特異分化培地は、表3のとおりである。分化誘導後8働く細胞で3胚葉の主要なタンパク質(GATA4、AFP、PAX6、Nestin、Brachyury、SMA)が発現された(図34)。
[199]
[表3]
バッジの種類 成分 含有量
バッジ1(外胚葉/性状細胞分化誘導培地) DMEMFBSN2 supplementGlutamax-I 1%1%1%
バッジ2(中胚葉/心筋細胞分化誘導培地) DMEMFBS2-mercaptoethanolNon必須アミノ酸acidPenicillin / streptomycinAscorbic酸 20%1%1%M100μM
バッジ3(内胚葉/神経細胞分化誘導培地) DMEMFBS2-mercaptoethanolNon必須アミノ酸acidPenicillin / streptomcin 20%1%1%

[200]
【表4】
遺伝子の名称 プライマー配列(5 ' - > 3')
AFP F GAATGCTGCAAACTGACCACGCTGGAAC
R TGGCATTCAAGAGGGTTTTCAGTCTGGA
FOXA2 F TGGGAGCGGTGAAGATGGAAGGGCAC
R TCATGCCAGCGCCCACGTACGACGAC
ブラキュリ F GCCCTCTCCCTCCCCTCCACGCACAG
R CGGCGCCGTTGCTCACAGACCACAGG
MSX1 F CGAGAGGACCCCGTGGATGCAGAG
R GGCGGCCATCTTCAGCTTCTCCAG
ACTA2(α-SMA) F CTATGAGGGCTATGCCTTGCC
R GCTCAGCAGTAGTAACGAAGGA
TNTC F ATGAGCGGGAGAAGGAGCGGCAGAAC
R TCAATGGCCAGCACCTTCCTCCTCTC
GATA4 F CGACACCCCAATCTCGATATG
R GTTGCACAGATAGTGACCCGT
NKX2.5 F CCAAGGACCCTAGAGCCGAA
R ATAGGCGGGGTAGGCGTTAT
ネスチン F GAAACAGCCATAGAGGGCAAA
R TGGTTTTCCAGAGTCTTCAGTGA
PAX6 F ACCCATTATCCAGATGTGTTTGCCCGAG
R ATGGTGAAGCTGGGCATAGGCGGCAG
マップ2 F CAGGTGGCGGACGTGTGAAAATTGAGAGTG
R CACGCTGGATCTGCCTGGGGACTGTG
GFAP F GGCCCGCCACTTGCAGGAGTACCAGG
R CTTCTGCTCGGGCCCCTCATGAGACG
SOX1 F TACAGCCCCATCTCCAACTC
R GCTCCGACTTCACCAGAGAG
チャット F GGAGGCGTGGAFCTCAGCGACACC
R CGGGGAGCTCGCTGACGGAGTCTG
AADC F CGCCAGGATCCCCGCTTGAAATCTG
R TCGGCCGCCAGCTCTTTGATGTGTTC
これ F ACAGAGGGGAGGTGCGCCAGTTCACG
R ACGGGGTGGACCTCGCTGCACAGATC
目 F CTGTGGCCTTTGAGGAGAAG
R GGTGGATTTTGGCTTCAAAC
TUJ1 F GAGCGGATCAGCGTCTACTACAA
R GATACTCCTCACGCACCTTGCT
VGLUT1 F CGACGACAGCCTTTTGTGGT
R GCCGAGACGTAGAAAACAGAG
VMAT2 F CTTTGGAGTTGGTTTTGC
R GAGTTGTGGTCCATGAG

[201]
[202]
図35及び図36に示すように、1〜2週間分化時期の間、遺伝子17(SOX17、内胚葉)、paired box 6(PAX6、外胚葉)、Nestin(神経細胞のマーカー)、microtubule-associated protein 2(MAP2、外胚葉)、class III beta-tubulin(TuJ1、神経細胞のマーカー)、msh homeobox 1(MSX1、中胚葉)、Brachyury(中胚葉)、myosin light chain 7(MYL7、心筋細胞)、NK2 homeobox 5(NKX2.5、心筋細胞)、およびTroponin T type 2(TnnT2、心筋細胞)を含むSRY-boxの発現がRT-PCRにより観察された。
[203]
特に、OCT3 / 4の発現が分化誘導後有意に減少した。
[204]
神経や心臓の細胞への分化はまた、免疫細胞化学によって確認された。
[205]
図37〜図39に示すように、性状細胞培地で育ったPhysics細胞から神経前駆細胞のマーカー(PAX6とNestin)が観察された。これらの分化したPhysics細胞は、性状、細胞培地を希突起膠細胞のバッジまたはニューロン培地に変更し、2週間の追加分化が誘導されたとき、それぞれ希突起膠細胞マーカー(MAP2とO4)またはニューロンマーカー(MAP2とTuj1)の発現この観察された。分化時期の2週MHC、SMA、Actinin、NKX2.5とTnTcを含む心臓マーカーを検出するのに十分であった。特に、典型的な分節されたアクチンパターンが液チニンで検出された。しかし、同じ培養条件下でHDFは、どのような神経や心臓マーカーを発現していなかった。
[206]
[207]
<実施例5>安定性検査
[208]
超音波は、突然変異、遺伝子組み換え、癌の発生などの望ましくない副作用を誘導しなかった。Physics細胞は、通常の核型を持っていた(図40)、
[209]
[210]
<実施例6> Physics細胞のある秘宝分化能の評価
[211]
Physics細胞のある秘宝分化能力を評価するために、5日培養されたPhysics細胞を4-5主な免疫不全マウス(NOD / SCID mouse)の精巣や太ももの筋肉に1×10 6細胞を注入して4週間飼育した後、精巣と筋肉を回収して、4%パラホルムアルデヒドで固定した後、冷凍切片(cryosection)してHuman Nuclear antigen染色を介して注入した細胞の位置を把握し、様々な増殖および分化に関連するタンパク質マーカーの(Ki67、CD44、SMA)を染色して注入された細胞の分化の有無を確認した。
[212]
図41から、精巣に注入されたPhysics細胞は、4週間後に精巣内の血管内皮細胞で観察され、Ki67染色を介して増殖していることを確認し、矢印で表示した細胞で見られるように、血管内皮細胞のマーカーであるCD44が染色されたことを確認した。
[213]
マウス太ももに注入された細胞は、筋肉繊維層部外者ラミナ層で発見され、筋肉のタンパク質マーカーであるSMA染色がされたことを確認した(図42)。このような結果は、体内に注入されたPhysics細胞が周囲の細胞との環境に合わせて分化されたことを示唆するものである。
[214]
[215]
<実施例7>細胞培養培地の効果
[216]
Physics細胞を発生させるために人ES細胞培養培地を使用した。ES細胞培養培地は、未分化状態でES細胞を維持し、繁殖するための制限バッジとして開発された。細胞培養培地の効果を調査するために、Physics細胞を発生させるために、通常のHDF培養培地を使用した。
[217]
も43aとbに示すように、ES細胞培養培地と比較して、形状やスペースロイド形成効率はかなり違っていた。超音波処理されたHDF培地でシディンした後、1日目に、多細胞スペインロイドは少量形成された。しかし、2日後に、大多数のスペースロイドは、プレートの表面に付着していた。培養4日目にすべてのスペースロイドは、プレートの表面に付着して、典型的な繊維芽細胞の形態で育った。免疫細胞化学の結果はまた、二種類の異なる培養培地の条件との間の他の遺伝子の発現パターンを示した。ES細胞培養培地を用いて発生された典型的なPhysics細胞はOCT3 / 4、SOX2、NANOG、SSEA-4、およびTRA-1-60の高い発現レベルを示した。DMEM培地は、未分化マーカー遺伝子および3胚葉マーカーの遺伝子発現を誘導するためのいかなる効果も見られなかった。これらの結果は、スペインロイドの形成と特異マーカー遺伝子の発現が細胞培養培地の成分と密接に関連していることを示唆するものである。
[218]
[219]
<実施例8>細胞株の効果
[220]
Physics細胞発生方法は、他の細胞株に適用することができるかどうか、今後の臨床適用に適用することができるかどうかを評価するために、HeLa細胞、L132人肺上皮細胞と患者 - 由来の皮膚繊維芽細胞のような他の細胞株を用いて、Physics細胞発生を調査した。
[221]
も44a-cに示すように、2種の細胞株はまた、超音波の直接暴露後の細菌のペトリ皿で​​超音波処理されたES細胞培養培地で培養された後、多細胞スペロイドを形成した。興味深いことにHDFから生じるPhysics細胞と比較して、2種の細胞株から生まれた新Physics細胞の形態およびサイズ​​分布はかなり異なっている。HeLa細胞由来のPhysics細胞の大きさの分布はかなり一貫性がなく、サイズがあまりにも大きかった。L132細胞由来のPhysics細胞は、より複雑で凝集された形態を示した。各スペースロイドは、追加の融合されて板 - ​​のような構造を形成した。
[222]
も44bと44cに示すように、2種の他のPhysics細胞からOCT3 / 4、SOX2、NANOG、SSEA4、およびTRA-1-60を含む多能性マーカーとGATA4、AFP、PAX6、Nestin、Brachyury、およびSMAを含む3胚葉のマーカー遺伝子の発現は、免疫細胞化学によって確認された。
[223]
そして、患者の皮膚細胞を用いた実験結果からもPhysics細胞のようなスペロイドを形成し、多能性マーカーと3胚葉マーカーの発現が免疫細胞化学によって確認された(図45)。
[224]
これらの結果は、Physics細胞の発生を誘導する超音波刺激が、様々な細胞株に適用できることを強く証明し、患者の細胞を用いた自家細胞治療の可能性を示した。
[225]
[226]
<実施例9>他のエネルギー源の提供の効果
[227]
追加の外部からの刺激をHDFと、ES細胞培養培地に加えPhysics細胞の発生メカニズムを確認し、評価した。
[228]
超音波処理の代わりにレーザー処理によってPhysics細胞が形成されるかを確認した。そのため、超音波処理に使用された人の皮膚繊維芽細胞を同じように使用し、レーザー処理条件は、Ocla治療用レーザー(Ndlux)を使用して、808nmのレーザーを5秒間照射した後培養した。
[229]
熱処理のために、皮膚の線維芽細胞を42℃で2分間露出させた後、アイスで約5秒間静置した。
[230]
図46および47に示すように、HDFと、ES細胞培養培地の両方にレーザーまたは熱処理後の多細胞スペロイドが正常に発生した。レーザー処理されたHDFはまた、レーザー誘導後多細胞スペロイドをすぐに形成した。たとえスペインロイドの形が不規則であり、サイズ分布が均一ではありませんが、多能性マーカーと3胚葉のマーカーの高レベルの発現が観察された。熱処理もスペインロイドの形成を誘導した。しかし、効率は超音波、レーザー処理よりも低かった。維持8日の間の熱によって誘導された多細胞スペロイドの半分以上が皿の表面に付着した。より低いスペロイド形成効率にもかかわらず、多能性マーカーと3胚葉マーカーの高い発現レベルが観察された。これらの結果は、Physics細胞の発生が物理的刺激と密接に関連していることを強く証明するものである。
[231]
[232]
<実施例10>マウスPhysics細胞の製造
[233]
図48に図示された手順に従って、マウスPhysics細胞を製造した。そのために、20KHzの超音波を5W / cm 2の強度で10分間処理したES培地にOG2マウスMEF(Mouse Embryonic Fibroblast cell;マウス胚繊維芽細胞)を混合し、その細胞に直接超音波を5秒間1W / cm 2の強さで処理して培養した。培養された細胞は、1、3、5、8、および10日の間隔で蛍光顕微鏡で細胞の形態変化とGFP蛍光の発現を観察した。超音波処理のための培地組成は表1の通りである。
[234]
上記MEF細胞は、OCT4プロモーターが挿入されたGFP遺伝子を形質転換させたマウスの13.5働いた胚の繊維芽細胞で、一般的には、OCT4が発現されない細胞や、もしOCT4が発現されると、GFPが発現されて緑色蛍光が見られる。
[235]
も49Aで対照群は、OG2 MEF細胞の写真道路緑色蛍光が認められなかった(OCT4発現がない)。しかし、超音波処理したOG2 MEFの場合、培養時間が経つにつれて、細胞球体のサイズが増加し、緑色蛍光の強度が強くなることが分かる。これは、超音波処理がOCT4発現を誘発したことを意味し、OCT4は未分化幹細胞の主要な特徴として、これは超音波処理によりOG2 MEF細胞が幹細胞で逆分化されることを知ることができる結果である。
[236]
も49Bは、Tile scan写真で広い範囲を複数の写真を撮って合わせた写真道路、超音波処理の効果を示す結果であり、多くのMEF細胞が超音波処理による逆分化にOCT4-GFPを発現し、も50で生成されたスペロイドのGFPの発現効率を分析した結果、約93%程度のOCT4-GFPの発現効率を示したし、フローサイトメトリーを用いて全細胞でのGFPの発現を確認した結果、約85.3%の細胞でGFPが発現されており、細胞表面未分化タンパク質マーカーであるSSEA1の発現を分析した結果でも約75.5%の発現が明らかになった(図51)。このような結果は、超音波による逆分化効率が非常に高いことを示唆している。
[237]
次に、下記表5に示されたプライマーセットを使用して、代表的なマウス胚性幹細胞(ESc)の未分化マーカー遺伝子とタンパク質マーカー(OCT4、SOX2、NANOG、SSEA1)の発現をRT-PCRと細胞免疫化学法で確認した。
[238]
図52および53に示すように、マウスPhysics細胞から未分化マーカーが発現されることを確認した。
[239]
また、アルカリホスフィンテイト染色を通じて確認した(図54)。
[240]
【表5】マウスES未分化マーカーの発現を確認するためのRT-PCR用プライマー
遺伝子の名称 プライマー配列(5'-3 ')
Oct3 / 4 F CTGAGGGCCAGGCAGGAGCACGAG
R CTGTAGGGAGGGCTTCGGGCACTT
Sox2の F TAGAGCTAGACTCCGGGCGATGA
R TTGCCTTAAACAAGACCACGAAA
Nanog F CAGGTGTTTGAGGGTAGCTC
R CGGTTCATCATGGTACAGTC
c-myc F TGACCTAACTCGAGGAGGAGCTGGAATC
R AAGTTTGAGGCAGTTAAAATTATGGCTGAAGC
Klf4の F GCGAACTCACACAGGCGAGAAACC
R TCGCTTCCTCTTCCTCCGACACA
ESG1 F GAAGTCTGGTTCCTTGGCAGGATG
R ACTCGATACACTGGCCTAGC
REX1 F ACGAGTGGCAGTTTCTTCTTGGGA
R TATGACTCACTTCCAGGGGGCACT
UTF1 F GGATGTCCCGGTGACTACGTCTG
R GGCGGATCTGGTTATCGAAGGGT
TDGF1 F ATGGACGCAACTGTGAACATGATGTTCGCA
R CTTTGAGGTCCTGGTCCATCACGTGACCAT
Esrrb F GTGGCTGAGGGCATCAATG
R AACCGAATGTCGTCCGAAGAC
Sall4 F TGGCAGACGAGAAGTTCTTTC
R TCCAACATTTATCCGAGCACAG
LIN28a F GGCATCTGTAAGTGGTTCAACG
R GCCAGTGACACGGATGGATT
B-アクチン F CTGGCTGGCCGGGACCTGAC
R ACCGCTCGTTGCCAATAGTGATGA

[241]
【表6】マウスの分化マーカーの発現を確認するためのRT-PCR用プタイマー
遺伝子の名称 プライマー配列(5'-3 ')
TUJ1 F ATCCACCTTCATTGGCAACAGCAC
R ACTCGGACACCAGGTCATTCATGT
マップ2 F AGCCGCAACGCCAATGGATT
R TTTGTTCCGAGGCTGGCGAT
GATA4 F AACCAGAAAACGGAAGCCCAAG
R TACGCGGTGATTATGTCCCCAT
SOX7 F AACACGCTGCCTGAGAAAAACG
R AATAGGCTGGAGATGGGGGACA
FOXA2 F TACACACACGCCAAACCTCCCT
R GCTTCCTTCAGTGCCAGTTGCT
CER1 F AGGCAGAAGACAAGCCGGATCT
R TCTTCATGGGCAATGGTCTGGT
ブラキュリ F CCCGGTGCTGAAGGTAAATGTG
R ATGAACTGGGTCTCGGGAAAGC
FLT-1 F TACGAAAAGTCCGTGTCCTCGC
R TTTCAGGTCCTCTCCTTCGGCT
CAD11 F AAGACCCAGATGCTGCCAACAG
R GCATGATTTCAGGGGGTAGGCT
KDR F TTTCCTGGGACTGTGGCGAA
R TGGACTCAATGGGCCTTCCA
Nef1 F CGGAAGACGCCACTAACGAGAA
R CTTCGGCGTTCTGCATGTTCTT
ネスチン F GGCATCCCTGAATTACCCAA
R AGCTCATGGGCATCTGTCAA
GATA6 F ACCTTATGGCGTAGAAATGCTGAGGGTG
R CTGAATACTTGAGGTCACTGTTCTCGGG

[242]
[243]
3胚葉のマーカーを確認した結果、mPhysicsは内胚葉(GATA6)、外胚葉(Nestin)、中胚葉(Brachyury)のマーカーを高く発現した。3胚葉の他の遺伝子の発現は、Physics細胞の生成後3日目に開始された。培養20日の間、3胚葉のマーカーの発現レベルは徐々に増加した(図55)。そして、図56で免疫染色を使用して、3胚葉タンパク質マーカーの発現が確認された。
[244]
マウス細胞でも、超音波により形成されたmPhysics細胞は正常核型を持っていた(図57)。
産業上の利用可能性

[245]
本発明の多能性細胞は、細胞治療剤の分野で使用することができる。
請求の範囲

[請求項1]
培養培地と分化された細胞を混合し、上記の混合物にエネルギーを提供して、一定時間培養を介してスペインロイド(spheroid)を形成することを含み、前記スペースロイドは多能性(pluripotency)特性を持つものである、分化した細胞で多能性細胞への逆分化方法。
【請求項2】
第1項において、エネルギーは、超音波、レーザーまたは熱処理のいずれかである、分化した細胞で多能性細胞への逆分化方法。
【請求項3】
第1項において、スペースロイドはOCT3 / 4、SOX2、NANOG、c-MYC、KLF4、TDGF1、SSEA4、TRA-1-60、PAX6、Nestin、Brachyury、SMA、GATA4、またはAFPのいずれかの未分化マーカーまたは3胚葉のマーカー遺伝子を発現するものである、分化した細胞で多能性細胞への逆分化方法。
【請求項4】
第1項において、分化された細胞は、哺乳類由来の繊維芽細胞、癌細胞または器官内の組織の細胞のいずれかである、分化した細胞で多能性細胞への逆分化方法。
【請求項5】
第1項において、培養培地は、胚性幹細胞培養培地または幹細胞の分化誘導培地のいずれかである、分化した細胞で多能性細胞への逆分化方法。
【請求項6】
第1項又は第2項において、培養培地と分化された細胞を混合する前に、培養培地に出力強度1W / cm 2 から20W / cm 2の超音波を1〜20分の間処理するステップをさらに含む、分化された細胞から多能性細胞への逆分化方法。
[請求項7]
第1項又は第2項において、培養培地と分化した細胞の混合物の超音波処理は、出力強度0.5W / cm 2から3W / cm 2で1〜5秒間処理することである、分化された細胞から多能性細胞での逆分化方法。
【請求項8】
第1項又は第2項において、培養培地と分化された細胞を混合する前に、培養培地に300〜900nmである波長帯域のパルス型レーザービームを1秒〜20秒の間照射するステップをさらに含む、分化した細胞で多能性細胞への逆分化方法。
【請求項9】
第1項又は第2項において、培養培地と分化した細胞の混合物のためのレーザー処理は、300〜900 nm波長帯域のパルス型レーザービームを1秒〜10秒の間照射するものである、分化された細胞で多能性細胞への逆分化方法。
【請求項10】
第1項又は第2項において、培養培地と分化された細胞を混合する前に、培養培地に40〜50℃の温度条件で5分〜20分の間熱処理する段階をさらに含む、分化した細胞で多能性細胞への逆分化方法。
【請求項11】
第1項又は第2項において、培養培地と分化した細胞の混合物の熱処理は、40〜50℃の温度条件で1分〜10分の間の露出した後、0℃〜4℃の温度条件で5 〜10秒間露出して実行されるものである、分化した細胞で多能性細胞への逆分化方法。
【請求項12】
第1項において、エネルギーが提供された混合物は、浮遊培養または単層培養の方法を使用して、3日〜10日間培養する、分化された細胞から多能性細胞への逆分化方法。
【請求項13】
細胞および培養培地を収容することができる培養チャンバー; 前記培養室の一側に配置され、上記細胞および培養培地にエネルギーを提供することができる装置を含み、分化された細胞と培養培地を混合して、上記の混合物にエネルギーを提供して、一定時間培養を介してスペインロイド(spheroid)を形成し、上記スペースロイドは多能性(pluripotency)特性を持つものである、多能性細胞の誘導装置。
【請求項14】
第13項において、インキュベーションチャンバーは、浮遊培養または単層培養方式が可能な構造になっている、多能性細胞の誘導装置。
【請求項15】
第13項において、エネルギーを提供することができる装置は、超音波を照射することができる超音波発生装置、レーザーを照射することができるレーザー発生装置、または温度調節装置を含んでいる、多能性細胞の誘導装置。
【請求項16】
第15項において、超音波発生装置は、周波数が10kHz乃至100MHzである超音波を発生するものである、多能性細胞の誘導装置。
【請求項17】
第15項において、レーザー発生装置は、300〜900 nmの波長帯域のパルス型レーザービームを発生するものである、多能性細胞の誘導装置。
【請求項18】
第15項において、温度調節装置は、-40℃〜99.9℃の範囲の温度調節が可能なものである、多能性細胞の誘導装置。
図面

[図1]

【図2a】

(編注;以下画像略)
【図2b】
【図3a】
【図3b】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7a】
【図7b】
【図8a】
【図8b】
【図9a】
【図9b】
明細書

発明の名称
技術分野

1
背景技術

2 3
発明の詳細な説明

技術的な課題

4
課題を解決する手段

5 6 7 8 9
発明の効果

10
図面の簡単な説明

11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76
発明を実施するための最良の形態

77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121
発明を実施するための形態

122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244
産業上の利用可能性

245
請求の範囲

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
図面

1 図2a 図2bの 第3a 図3b 4 5 6 図7aの 7bは 図8Aの 8B 9Aの 9Bの 10Aの 10B 11 12 13 14 15 16aは 16bとの 16C 17 18 19 20 21aと 21bの 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44aは 44bとの 44C 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57
公開後の変更のお知らせ
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09.06.2016 A1



KR2015013269-1.png


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posted by Kose at 19:46| STAP

【有志の会】韓国の研究機関でエネルギーを利用して細胞の多能性確認・特許申請へ 「STAP現象」報告続々

私が先に勝手にここでまとめちゃった新特許の件を、「有志の会」ブログが、「詳細はのちほど」と言うことですが、記事にしました。

「制限」は私です。「制限」の指摘は『STAP細胞はなぜ潰されたのか ~小保方晴子『あの日』の真実~』の渋谷一郎さんによるものです。私は何もせず、他人のふんどしで相撲を取っているだけで申し訳ない。善意に「触媒」としての役割を果たしている理解してくださるとうれしい。

「ちゃんと読んでね」さんは、

ここまでくると、「おぼちゃん、やっぱり無罪」でいいと思うな。

だそうです。

日本から追放して、欧米と韓国で成功した技術に未だ世間は沈黙。もう「無罪」だけでは済まない段階だと。つまり小保方さんをギルティとした人々の罪が問われる局面に突然入ってしまった。この事態はいろいろ日付を見ると6月後半にはわかっていたことであると思われる。したがってギルティな人たちをどうするか水面下で慎重に検討している最中だとおもっても的外れでないと思う。BPO勧告がでると、世論は動くのでどうするんですかね?その人たち。

おひとり人の命が失われていることも忘れてはならない。故笹井先生が手掛けた研究がウソだという日本の二流の科学者たちの言うことは海外の研究者は歯牙にもかけなかったわけだ。撤回は無視されている。理研は撤回を撤回する手続き取るべきだね。どうしたらできるか知らないけど。特許の回復は現状では困難だね。どうするんだろう。本当に。「覆水盆に返らず」って取りあえず書いておく。


韓国の研究機関でエネルギーを利用して細胞の多能性確認・特許申請へ 「STAP現象」報告続々
小保方晴子さんへの不正な報道を追及する有志の会 2016年08月30日
http://blog.livedoor.jp/obokata_file-stap/archives/1060636425.html

詳細はのちほど。

肯定派の人も否定派の人も、活発な議論を宜しくお願いします。

131. ちゃんと読んでね 2016年08月28日 23:19
2016年6月9日にSTAP特許を引用した韓国の「カトリック関東大学校産学協力団」の国際特許、「エネルギーを利用した多能性細胞の誘導装置及び方法」が公開されてるよ。

「分化された細胞に超音波、レーザーまたは熱処理などのエネルギーを加えて、3胚葉に分化する多能性細胞、Physics(Pluripotent sp h ere y ielded by ultra s on ic s timulus)細胞を誘導する新しい方法を開発した。」 Physics細胞だって。

ES培養培地と分化した細胞(繊維芽細胞、癌細胞または器官内の組織細胞)の混合物にエネルギー(超音波、レーザー等)を加えて一定時間培養をすると、スペロイド(spheroid)を形成して多能性をもつようになる。うーん、これはSTAP細胞だよね。

https://patentscope2.wipo.int/search/en/detail.jsf?docId=WO2016089178&recNum=1&maxRec=&office=&prevFilter=&sortOption=&queryString=&tab=PCT+Biblio
00)


制限>131.ちゃんと読んでねさん
「分化された細胞に超音波、レーザーまたは熱処理などのエネルギーを加えて」
の物理的刺激は、STAP特許の下記の<< >>項目に該当との指摘。研究としてはSTAPそのもの。

【請求項13】
 ストレスが以下から選択される少なくとも1つの環境刺激への細胞の曝露を含む、請求項1〜12のいずれか1項記載の方法:外傷、機械的刺激、化学的曝露、<<超音波刺激>>、酸素欠乏、照射、<<極度な温度への曝露>>、解離、トリチュレーション、<<物理的ストレス>>、高浸、透圧、低浸透圧、膜損傷、毒素、極度のイオン濃度、活性酸素、UV曝露、<<強可視光>>、必須栄養の欠乏、または非生理的酸性環境。

142. ちゃんと読んでね 2016年08月29日 21:44
>134 制限さん
確かにSTAP特許は請求項13でちゃんと抑えてますね。
エネルギーは物理刺激だし、スペロイド(spheroid)って細胞塊のことかな。この特許でも、「Physics細胞の発生が物理的刺激と密接に関連している」と書いてるし、STAP細胞の再現に成功という話ですね。もっとも、酸浴よりも機械的だからこちらの方が再現性は高そうだけど。もう、ここまでくると、「おぼちゃん、やっぱり無罪」でいいと思うな。

posted by Kose at 14:32| STAP

【産経】「天国の階段イントロ問題」

問題の部分は
Im|ImM7|Im7|VI7(9)|
というルート音が半音ずつ下降するコード進行で、これは通常クリシェとして知られる一般的なものである。
これ自体はパクリでもなんでもないし、少しコードの知識があれば、マイナーコードで、ルートが半音下降するとどんな風かな、というのだ誰でも思いつく。
ただし鍵盤楽器だとなんでもないが、ギターだとmM7は押さえやすいとはいえず、このクリシェ以外ではあまり弾かないんじゃないか?ジャズなら違うかもしれないが。
問題はできた一部が聞くと似ているということだ。

Led Zeppelin - Stairway To Heaven


Spirit - Taurus


重要なのはこのクリシェをさらに曲に展開するのに明らかにツェッペリンは成功している。つまり他のコード進行への展開が見事である。楽曲として、スコッツ=ケルティックな音楽的背景(ツェッペリンにはたびたび登場する)に引用しているのに対して、スピリッツの方はどちらかと言うとプログレ風なんであろう。この曲の壮大さは、途中で完全なハードロックにさらに展開し、最後は元のクリシェに戻る。もしハードロックになってそのままフェイドアウトしていたら、最初のイントロは解決していなかったことになるかもしれない。
ちなみ、記事で参照されているクラプトンさんの「Let It Grow」(461オーシャンブールバード)も同じクリシェである。自伝で後から同じコード進行を使ったこと知ったと弁明しているが、以前に書いたが、ジョージ・ハリスンの「ホワイル・マイ・ギター・ジェントリー・ウィープス」が完全に同じでないが、マイナーコードのルートが下降するアイディアではもっともはやくロックで成功したものだと思うのである。
まったくくだらない。

クラプトンさん


ジョージ・ハリスンさん *ギターソロはクラプトンさん


「天国への階段」イントロは平凡? ジミー・ペイジ勝訴、ジェフ・ベックのコメントは「ラッキー」
産経新聞WEST 2016.8.30 11:11
http://www.sankei.com/west/news/160830/wst1608300002-n1.html
 ロック史上、最も有名なフレーズの一つ『天国への階段』(1971年、レッド・ツェッペリン=英国)のイントロ。盗作疑惑が持ち上がり訴訟になったが、作曲した元メンバーのジミー・ペイジ氏は否定し、勝訴した。「昔からある珍しくもない旋律。盗むというほどのものでもない」というのが認められた主張のあらましだ。その平凡な旋律は、年間10億円規模の著作権収入を生むとされ、盗作を訴えた原告側はあきらめていない。

確かにそっくり

 元祖『天国への階段』として浮上したのは、60年代に活動した米国のロックバンド、スピリットの楽曲『トーラス』(67年)。同バンドのギターリスト、故ランディ・カリフォルニア氏(本名ランディ・ウルフ)が作曲した。
 訴訟は2014年にロサンゼルスの裁判所に提起され、大きな注目を集めた。米CNNは実際に2曲をギターで弾き比べて紹介。いずれも和音(コード)を分散して弾くアルペジオという手法で、本当によく似ている。法廷でも当然、2曲が流された。
 ロイター通信によると、原告側は、ツェッペリンとスピリットの両バンドは、『天国への階段』が発表される前に、一緒にツアーをしたことがあると指摘。ペイジ氏は『トーラス』を耳にしているはず、と主張した。
 今年7月に出廷したペイジ氏は『トーラス』から旋律を盗んだり、ヒントにしたりしたことはないと否定。同曲を収録したスピリットのレコードは持っているが、訴えを起こされるまで「ほとんど聴いた覚えがない」とした。

よくあること

 ペイジ氏はしかし「確かに2曲のコード進行はとても似ている。どこにでもあるものだから」とも述べ、64年のミュージカル映画『メリー・ポピンズ』の曲にも「似ている」とした。ペイジ氏側の弁護士が証人として呼んだ専門家は、これらのコード進行について「300年もの昔から多くの大衆音楽で使われている」と述べた。
 場外からも「そんなのよくあること」との声が。
 ハードロック界のカリスマ、オジー・オズボーン氏は米ローリング・ストーン誌のインタビューで、そっくりな曲はほかにもあるとして具体例を挙げた上で「訴えたりはしないものだ」と原告側を批判した。
 ペイジ氏、エリック・クラプトン氏と並び、三大ギターリストの1人と称されるジェフ・ベック氏は、米ビルボード誌のインタビューでチクリとやった。問題のコード進行は「これまでもたくさん使われてきた」としながら「あれほど象徴的に使われたことはなかった」。『天国への階段』はお手軽に作った曲とでも言いたげで、ペイジ氏の勝訴を「ラッキー」と表現した。

2匹目のドジョウはいなかった

 原告が求めたのは『天国への階段』の作曲者クレジットにカリフォルニア氏の名前を入れること、そして当然、お金だった。
 業界誌の推計によると、同曲のロイヤルティー収入は08年時点で累計5億6千万ドルに上る。昨年1年間で、ツェッペリンの元メンバーと遺族らは9百万ドル(約9億円)以上の収入を得たとみられている。
 実は『天国への階段』訴訟を扱った裁判所は昨年、別のヒット曲で盗作があったことを認定し、巨額の賠償を命じた評決を出している。
 原告はソウルシンガー、マーヴィン・ゲイ氏(故人)の遺族ら。13年最大のヒット曲とされるロビン・シック氏の『ブラード・ラインズ』は、ゲイ氏の『ゲット・トゥ・ギブ・イット・アップ』(1977年)の盗作だと訴えた。
 米メディアなどによると、シンク氏とプロデューサーのファレル・ウィリアムズ氏側は「子供の頃からゲイ氏のファンだった。しかし曲が似ているのはジャンルだけ」などと訴えたが、かなわず、原告側は740万ドルを勝ち取った。
 『天国への階段』訴訟で、原告側は2匹目のドジョウと期待していたかも知れない。甘くはなかったが、抗告し巻き返しを図る姿勢だ。一方、ペイジ氏らは訴訟費用の負担を求めて訴えを起こした。戦いは続く。
posted by Kose at 12:58| Music Story

小保方晴子さんを応援する人のためのクイズ

つぎのお二人の姓名を当ててください。これに正解できればSTAP細胞事件問題の中級者以上です。
1.
Kiyoka-Wakayama_edited.jpg
2.
obokata_2007.jpg
posted by Kose at 09:20| STAP

2016年08月29日

NAVERまとめ 【削除覚悟】小保方氏とSTAP細胞潰しにはこんな裏が・・・?まだ終わっていない!

主に木星さん/上田眞実記者の「有志の会」ブログとBusiness Journalの記事を中心の小保方晴子さん、STAP細胞に関する記事の網羅的なまとめです。保存版と言ってよいでしょう。
大量であり、ぼくはまだ見終わってません(就寝時間のため)。
ここでご紹介済みのものも多くあります。最近のものはここ発信であったりしますが、ここまでやっていただいたことに大変感謝します。

【削除覚悟】小保方氏とSTAP細胞潰しにはこんな裏が・・・?まだ終わっていない!
http://matome.naver.jp/odai/2142776694562403801
STAP細胞論文を巡る問題で、理化学研究所の調査委員会は2014年12月26日に最終報告書を発表し、「STAP論文は、ほぼすべて否定された」と結論付けました。しかし、どうも怪しい匂いがプンプンしませんか? 更新日: 2016年08月20日
kkmiraiさん

ワシントン大学がSTAP細胞論文を引用_癌細胞を酸性浴で多能性確認
http://blog.livedoor.jp/obokata_file-stap/archives/1060247545.html
小保方さんの発明した理論は多くの研究者に影響を与え、インスパイアを引き起しています。否定しているのは日本だけです。
これを作為的に作り出したのが小保方さんの主張する「STAP現象」により産出された細胞「STAP細胞」であるという理解で宜しいかと思います。
参考文献として小保方さん筆頭の論文「STAP細胞論文」が紹介されています。

朝日新聞、「海外STAP細胞論文発表」記事の掲載を一旦拒否…何度も執筆者に修正要求
http://biz-journal.jp/2016/08/post_16176.html
私は、7つの媒体で記事を書いている。そのひとつに、朝日新聞の「WEBRONZA(以下、RONZA)」がある。
私はひとつの決意のもと、「米国とドイツでSTAP細胞関連の論文発表 不都合な事実を無視するマスメディア」と題する記事を寄稿してみた。
私は、RONZA用の原稿を7月3日に朝日新聞の担当者に送った。しかし、このままでは公開できないと担当者からは拒絶された。数回のやり取りの後、私は担当者に「これ以上の修正を要求するなら、『RONZAでは投稿を拒否された』事実を含めて、どこか別の媒体に投稿する」と告げた。

小保方氏冷凍庫に存在したDr.LiのES細胞のインタビュー記事について。
http://blog.livedoor.jp/obokata_file-stap/archives/1059879940.html
小保方氏の冷凍庫に存在したLi氏のES細胞について、Li氏本人にインタビューした記事を確認いたしました。
写真週刊誌フライデーの記事を否定しています。

STAP細胞が証明された !ドイツ研究チームがSTAP再現に成功!
http://snjpn.net/archives/4927
今年3月10日、ドイツの名門大学、ハイデルベルク大学の研究グループがSTAP関連の論文を発表した。海外の一流大学が、いわゆる「STAP現象」の再現実験を行ったということで話題となっている。

続きをNAVARまとめで見る・・・
posted by Kose at 21:33| STAP

STAP概念が該当する新特許請求あり―国際特許「エネルギーを利用した多能性細胞の誘導装置及び方法」

「有志の会」ブログコメントへの投稿で、故笹井博士の定義によるSTAP細胞の概念に該当する新たな国際特許が請求が公開されていることが判明。
 もっぱら、有志の会ちゃんと読んでねさん、FB楠本英正さんの情報提供、渋谷一郎さんの解説によるものです。たいへん感謝します。
 STAP細胞の適切で誤解の余地のない故笹井芳樹博士の概念化の正当性がまた明らかになったことを大変喜びます。天国の先生のご威光は世界の研究者を照らしているようです。「再現実験に成功してください」のお言葉は、小保方晴子さんにとどまらず、世界に響いております。改めて哀悼の意を表します。

ワシントン大学がSTAP細胞論文を引用_癌細胞を酸性浴で多能性確認
小保方晴子さんへの不正な報道を追及する有志の会
http://blog.livedoor.jp/obokata_file-stap/archives/1060247545.html#comments
コメント 131. 2016年08月28日 23:19

2016年6月9日にSTAP特許を引用した韓国の「カトリック関東大学校産学協力団」の国際特許、「エネルギーを利用した多能性細胞の誘導装置及び方法」が公開されてるよ。

「分化された細胞に超音波、レーザーまたは熱処理などのエネルギーを加えて、3胚葉に分化する多能性細胞、Physics(Pluripotent sp h ere y ielded by ultra s on ic s timulus)細胞を誘導する新しい方法を開発した。」 Physics細胞だって。

ES培養培地と分化した細胞(繊維芽細胞、癌細胞または器官内の組織細胞)の混合物にエネルギー(超音波、レーザー等)を加えて一定時間培養をすると、スペロイド(spheroid)を形成して多能性をもつようになる。うーん、これはSTAP細胞だよね。

https://patentscope2.wipo.int/search/en/detail.jsf?docId=WO2016089178&recNum=1&maxRec=&office=&prevFilter=&sortOption=&queryString=&tab=PCT+Biblio


これについては渋谷一郎さんが指摘
 *STAP特許の物理的刺激の該当するタイプを<<>>で囲み太字にして私が明確化。
「Stimulus-Triggered Acquisition of Pluripotency(刺激惹起性多能性獲得)」の「刺激」のところを、「超音波、レーザーまたは熱処理などのエネルギー」でやってみたということですね。
おそらく、STAP細胞特許を回避するための方策ではないでしょうか。

STAP細胞特許では、外的な刺激は概略、以下のように規定されています。
「超音波、レーザーまたは熱処理などのエネルギー」が【請求項13】の方法に抵触するかどうかがポイントと思いますが、「超音波刺激」「極度な温度への曝露」が入っているのでアウトのような気がします。

=================================

【書類名】特許請求の範囲
【請求項1】
 細胞をストレスに供する工程を含む、多能性細胞を生成する方法。
【請求項2】
 多能性細胞が外来遺伝子、転写物、タンパク質、核成分もしくは細胞質の導入なしに、または細胞融合なしに生成される、請求項1記載の方法。
【請求項3】
 多能性を示す細胞を選択する工程をさらに含む、請求項1または2記載の方法。
【請求項4】
 細胞が組織の部分として存在しない、請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。
【請求項5】
 細胞が体細胞、幹細胞、前駆細胞または胚細胞である、請求項1〜4のいずれか1項記載の方法。
【請求項6】
 細胞が単離された細胞である、請求項1〜5のいずれか1項記載の方法。
【請求項7】
 細胞が細胞の不均一な集団中に存在する、請求項1〜6のいずれか1項記載の方法。
【請求項8】
 細胞が細胞の均一な集団中に存在する、請求項1〜7のいずれか1項記載の方法。
【請求項9】
 多能性を示す細胞を選択する工程が、幹細胞マーカーを発現する細胞を選択することを
含む、請求項1〜8のいずれか1項記載の方法。
【請求項10】
 幹細胞マーカーが以下からなる群より選択される、請求項9記載の方法:
Oct4;Nanog;E−カドヘリン、およびSSEA。
【請求項11】
 多能性を示す細胞を選択する工程が、接着性でない細胞を選択することを含む、請求項1〜10のいずれか1項記載の方法。
【請求項12】
 ストレスが組織または細胞培養物における非生理的ストレスを含む、請求項1〜11のいずれか1項記載の方法。
【請求項13】
 ストレスが以下から選択される少なくとも1つの環境刺激への細胞の曝露を含む、請求項1〜12のいずれか1項記載の方法:外傷、機械的刺激、化学的曝露、<<超音波刺激>>、酸素欠乏、照射、<<極度な温度への曝露>>、解離、トリチュレーション、<<物理的ストレス>>、高浸透圧、低浸透圧、膜損傷、毒素、極度のイオン濃度、活性酸素、UV曝露、<<強可視光>>、必須栄養の欠乏、または非生理的酸性環境。

「特許出願権を第三者に譲渡する以上は、瑕疵担保的責任が問われない程度の裏付けがあるのではないか?」(理研STAP細胞論文調査委員会報告、改革委提言等への根本的疑問) http://blogs.yahoo.co.jp/teabreakt2/17359251.html


特許としては、すでに実体審査に入っているSTAP特許の牽制対象の特許となる可能性がある。

研究の概念は故笹井博士が命名したSTAP細胞のそれそのものであるため、これはSTAP細胞の実験の別の物理的刺激による成功を示唆していると考えられる。



毎日目まぐるしい展開ですね。科学ジャーナリズム何やってんだか???
posted by Kose at 06:58| STAP

2016年08月28日

STAP細胞実験の論理分析の価値はタバコ一箱

本当にバカバカしいと思うのだが、形式論理がわかっておらず、日常語と取り違えている程度の低い科学ライターとそのエピゴーネンを黙らすため、頭を使いまくった。一度ベン図を使って分かりやすく書いたのだが、その後急遽方針を変えて、もっと厳密に真理表を使って、推論の方向が逆であることを示す戦略に変えた。

結果としてキメラマウス作成をアクセプトの条件としたProceedings of the National Academy of Science(PNAS)の査読者が科学より医療系の人間であって応用可能な幹細胞の証明を求めたのは「頭がおかしい」と言っているのである。この点に関してはバカンティ氏が「体内に微小な<幹細胞>がある」という仮説のものとで、スフェア細胞を解釈していたため、現象の新規性より、幹細胞であることに暗黙裡に期待があったことも関係するかもしれない。この点はバカンティ研に幹細胞学者がいなかったことの影響だと言えるだろう。しかしバカンティ氏は、論文掲載雑誌のレベルを下げることを一度は決心したのであって、キメラマウスで若山研に行ったのは、小保方さんが日本に戻り、指導教官と相談したその偶然の結果である。こうして、現実に多能性発現と、分化可能な幹細胞の間で、曖昧な理解があり、結果的に、超人若山照彦博士の意図せざる成功の位置づけも、事件化とともに曖昧になってしまったという結論である。

完全な科学の素人がこの事件の要件に、正確な解釈を与えるのに使ったエネルギーはタバコ一箱位の消費に相当する。

ゆっくり寝たい。

追加:
アクセスが多いので、またDoS攻撃受けているのかと思ったら、アクセス者数とアクセス回数の非が1:2程度以内に収まっている。DoS攻撃だと1:10位になるのは経験的にわかっている。なんだか本当の来訪者が多いみたいだ。ばかなこと書かないように気を付けたいとは思うが、突然この歳になってディスポジションを変えるのは難しいと思う。

おやすみなさい。
posted by Kose at 18:46| STAP